基于轉錄組的百香果ARF基因家族的鑒定及表達分析

張小雪, 韋曉霞, 陳發興

(1.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建省農業科學院果樹研究所，福建 福州 350013)

生長素是一種重要的植物激素，在植物生長發育過程的各個階段，如胚胎形成、花果發育、頂端優勢、維管伸長、葉片膨脹和衰老、側根形成以及對逆境脅迫響應等，均發揮著重要調控作用[1-3].生長素應答基因在植物生長發育過程中的表達受到生長素響應因子(auxin response factor, ARF)和Aux/IAA( auxin/indole acetic acid)轉錄因子的調控[4].近年來，人們對ARF基因的分子結構、表達模式等進行了大量研究，對不同植物ARF基因的功能及調控機制等方面的研究也逐漸深入[5].ARF是一類能夠特異性識別并結合生長素響應基因啟動子區域的AuxREs (TGTCTC) 或其突變體(TGTCCC、TGTCAC和TGTCGG)，進而促進或者抑制靶基因表達的轉錄因子[6].典型的ARFs蛋白常包含3個保守的結構域，即N端DNA結合結構域(DNA-binding domain, DBD)、C端的二聚體結構域(carboxy-terminal dimerization domain, CDT)和可變的中間結構域(middle region, MR).可變中間區域具有轉錄激活或抑制作用，激活域富含谷氨酰胺(Q)，而抑制域富含脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、絲氨酸(S)和亮氨酸(L)[7-8].

擬南芥和其他植物的遺傳與分子研究顯示，ARF蛋白在控制植物生長發育的調控網絡中起著關鍵作用，其成員的突變會造成不同的植株表型變異.如：AtARF2突變會導致植株晚花、葉片衰老延遲以及種子數量增加[9]；AtARF1/AtARF2雙突變體與單突變體表型相似，但表型性狀都進一步加強[10]，表明ARF1與ARF2在功能上具有疊加效應；AtARF6和AtARF8是一對功能冗余的與雌雄蕊生殖能力相關的轉錄因子，ARF6/ARF8雙突變體雄蕊花絲變短，花藥延遲開裂，導致植株雌性不育[11]；AtARF7/AtARF19雙突變會抑制不定根的形成和減少側根數量，而單體突變對不定根和側根發育無較大影響，表明二者存在功能上的互補[12].OsARF16參與水稻對磷酸鹽饑餓下的應激反應[13]；OsARF19通過正調控OsGH3-5和OsBR11控制水稻葉片夾角大小[14].關于ARF在果實成熟過程中的調控機制，現有的研究多集中于番茄[15].番茄中共含有21個ARF家族成員[16]，其中SlARF2通過負調控與果實成熟相關的調控因子(RIN、CNR、NOR、TAGL1)從而抑制果實成熟[17]；SlARF4通過調控糖代謝從而影響果實早期發育[18]；SlARF9調控發育早期果實的細胞分裂[19]；SlARF12負調控果實膨大但不參與坐果的啟動過程[20]；而SlARF10則參與調控果實中葉綠素的形成、淀粉的合成以及糖物質的積累[21].

盡管ARF基因在植物生長發育的多個方面發揮著重要的作用，但這些基因家族在多年生植物中，尤其是西番蓮科的多年生植物中的研究仍然相對匱乏.百香果學名西番蓮(PassifloraedulisSims)，是西番蓮科西番蓮屬的幾種植物的統稱，主要分布于熱帶和亞熱帶氣候地區，為當地農民的經濟產業和增收產業[22].‘福建3號’(黃果)和‘福建1號’(紫果)是福建省多個地區均有栽培的優質鮮食百香果品種.本研究基于課題組百香果果肉不同發育時期的轉錄組數據，利用BlastP程序篩選并鑒定出果肉中ARF家族成員，并對其編碼蛋白理化性質、亞細胞定位、保守結構域和系統進化進行分析，同時研究了ARF家族成員在果肉不同發育時期的差異表達模式.預期本研究可為今后百香果ARF基因的功能研究奠定一定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用‘福建3號’(黃果)和‘福建1號’(紫果)果實于2019年采自福建省龍巖市永定區百香果果園.根據Tu et al[23]的標準，將百香果果實分為幼果期(fruitlet)、綠果期(green)、轉色期(veraison)、成熟期(maturation).于‘黃果’盛花后的40、55、70和80 d進行取樣，于‘紫果’盛花后的30、44、50和60 d進行取樣.選擇園內12株無病蟲害、樹勢健壯的果樹，每株從當年一年生的藤蔓上選取3個形態特征及成熟度相似的果實.采樣當天運回實驗室，用水果刀將果實去皮留肉，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用.

1.2 方法

1.2.1 百香果ARF家族成員的鑒定 從TAIR數據庫(https://www. arabidopsis.org/index. jsp)和Phytozome12基因組數據庫(https:// phytozome .jgi .doe. gov/pz /portal.html)分別下載擬南芥和毛果楊的蛋白質序列文件.首先用百香果轉錄組的蛋白序列文件構建本地Blast數據庫，然后以已報道的23條擬南芥ARF蛋白序列為誘餌進行blastp搜索比對.同時，利用HMMER v3.0軟件構建ARF的HMM模型，篩選出百香果中含有ARF結構域的蛋白序列(E≤10-5).最后，利用NCBI的CCD數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)檢測蛋白結構域，剔除不同時含B3和ARF結構域的蛋白序列.

1.2.2 百香果ARF蛋白的保守結構域及Motif分析 利用在線軟件ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預測百香果ARF蛋白的理化性質，并利用Softberry(http://www.softberry.com/)預測其亞細胞定位.利用NCBI的在線分析工具CDD和MEME 5.1.1鑒定PeARF蛋白的保守結構域和保守基序，并采用TBtools進行圖形的可視化.

1.2.3 百香果ARF蛋白的進化分析 利用MUSCLE對百香果、擬南芥和毛果楊中的ARFs氨基酸序列進行多重序列比對，在MEGA X中采用鄰接法(NJ)構建系統發育樹，Bootstrap method取值1 000、Poission model 和pairwise deletion，其余參數默認，利用Evolview對基本樹進行進一步美化.

1.2.4 百香果ARF表達分析 利用本課題組的RNA-seq數據，篩選出兩品種在4個發育時期的基因表達數據，基于其FPKM值，利用用TBtools軟件對數據采用log法均一化處理并進行熱圖的繪制.

2 結果與分析

2.1 百香果ARF基因家族鑒定及蛋白特性分析

通過對轉錄組數據庫的本地Blast比對檢索和HMMER搜素，得到50個百香果ARF候選基因，經CCD在線數據庫對保守結構域篩選以及剔除不同時含B3和ARF結構域的蛋白序列，最終得到13條百香果ARF蛋白序列，分別命名為PeARFl～13(表1).對13個PeARF基因綜合分析表明，不同ARF蛋白間的差異較大：編碼ARF蛋白的氨基酸長度范圍從365 aa(PeARF1)到970 aa(PeARF13)，編碼區從1 098 bp(PeARF1)到2913 bp(PeARF13)，分子質量從39.95 ku(PeARF1)到106.33 ku(PeARF13)；等電點范圍從5.40(PeARF13)到8.94(PeARF1)，69%的成員等電點小于7，屬酸性蛋白，在酸性環境下發揮作用.所有PeARF蛋白的不穩定指數均大于43且親水系數呈負值，表明13個PeARF均為不穩定的親水蛋白質；亞細胞定位預測結果表明，13個ARF蛋白質均位于細胞核.

表1 百香果ARF家族基因基本信息Table 1 Basic information of ARF family genes in passion fruit

2.2 百香果ARF家族蛋白的進化分析

為了解‘黃果’和‘紫果’ARF蛋白進化情況，采用MEGAX軟件構建了百香果(13個)、擬南芥(23個)和毛果楊 (39個)ARFs系統進化樹(圖1).進化樹結果顯示，75個ARF成員可被清晰的劃分為4個亞家族：ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ和ClassⅣ，且每組中均含有上述3個物種的成員.其中ClassⅠ包含5個PeARF(PeARF6、PeARF3、PeARF8、PeARF2、PeARF12)，ClassⅡ包含2個PeARFs(PeARF13、PeARF11)，ClassⅢ包含2個PeARFs(PeARF7、PeARF4)，ClassⅣ包含4個PeARFs(PeARF1、PeARF10、PeARF5、PeARF9).除PeARF3和PeARF11外，其他成員均能在毛果楊中找到同源序列.在ClassⅠ中，AtARF12-15、20-23等8個擬南芥成員單獨聚在一個小分支上，在百香果和毛果楊等其他2種果樹中均未發現與其高度同源的序列.

bootstrap測驗采用1 000次重復，節點上的數字代表分枝的可信度，不同分組ARF蛋白的分枝顏色不同.來自百香果的ARF蛋白以‘PeARF’表示，來自擬南芥的ARF蛋白以‘AtARF’表示，來自毛果楊的ARF蛋白以‘PoptrARF’表示.圖1 百香果與擬南芥、毛果楊ARF基因家族的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the ARFs genes from passion fruit, Arabidopis and Populus trichocarpa

2.3 百香果ARF蛋白結構及保守基序分析

通過CDD數據庫在線分析每個ARF蛋白的結構域(圖2和表1).結果表明，所有百香果ARF蛋白均含有B3和Auxin_resp結構域，而PeARF6、PeARF8、PeARF12和PeARF13序列的C末端還存在AUX_IAA結構域.

圖2 PeARF家族蛋白質保守結構域分析Fig.2 Conserved domains of the PeARF family proteins

利用在線網站MEME在PeARF中鑒定獲得15個保守基序(圖3).不同PeARF蛋白序列的基序類型和數量都存在一定的差異.基序1、2屬于B3結構域，它們與基序3和基序7共同構成DNA結合結構域；基序4、5、6、10和 12 屬于Auxin_resp結構域；基序8 和 11屬于AUX_IAA結構域；基序9、13、14 和 15為未知結構域.除PeARF6外，所有序列均含有DNA結合結構域的4個基序，且PeARF7包含兩個基序3.13個PeARFs均至少含有Auxin_resp結構域5個基序中的3個(PeARF6、PeARF3和PeARF8缺失基序6、12，PeARF2、PeARF12、ClassⅡ和ClassⅢ中所有成員均缺失基序12，ClassⅣ中所有成員均缺失基序5).PeARF6、PeARF8、PeARF9、PeARF10、PeARF12和PeARF13含有AUX_IAA結構域中的所有2個基序，而其它成員無該基序.此外，除PeARF1和PeARF3外，所有序列均含有未知基序9，未知基序13和14僅存在于ClassⅣ成員中(PeARF1不含基序13)，而未知基序15只存在于PeARF3、PeARF6 和PeARF8中.

圖3 百香果ARF蛋白的保守Motif分析Fig.3 Conserved motifs in passion fruit ARF proteins

為進一步明確PeARFs的蛋白保守結構域，采用MEGAX 比對和Genedoc軟件分析，發現B3 DNA結構域在百香果中高度保守，其中41個氨基酸在所有的序列(PeARF6除外)中完全保守，約占結構域(102 aa)平均長度的40.2%；而在具有轉錄激活或抑制的中心功能區，PeARF11、PeARF13富含谷氨酰胺，PeARF2、PeARF3、PeARF4、PeARF6、PeARF7、PeARF8、PeARF9、PeARF10、PeARF12富含絲氨酸.

2.4 PeARF家族基因的表達分析

從‘黃果’和‘紫果’轉錄組數據中提取13個PeARF在4個果實發育期的表達數據.由圖4可知，多數PeARF基因在果實的不同發育時期均有表達，但PeARF3在兩品種的所有發育時期表達極低甚至不表達.隨著果實的發育，大部分ARF家族成員的表達量均隨著果實的成熟而下降，僅PeARF12在果實的綠果期至成熟期持續增加.如ClassⅠ中的PeARF6、PeARF8；ClassⅢ中的PeARF7以及ClassⅣ中的PeARF1、PeARF10在兩品種中的表達量均于幼果期達最高值，至成熟期降至最低；而ClassⅢ中的PeARF4、ClassⅣ中的PeARF5、PeARF9在‘黃果’中的表達量僅于綠果期至轉色期略有增加，隨后迅速下降，但在‘紫果’中的表達量持續下降.值得注意的是，ClassⅡ中的PeARF11和PeARF13在‘黃果’和‘紫果’的轉色期后均呈上升趨勢.

圖4 ‘黃果’和‘紫果’果實成熟過程中PeARF家族基因的表達Fig.4 Heatmap representation of the PeARF genes of ‘yellow passion ruit’ and ‘purple passion fruit’ during ripening

3 討論與結論

生長素和生長素信號是植物發育過程中大多數器官發生的關鍵信號傳導分子，它廣泛地參與植物的生理生化進程，包括器官的形態建成、花果發育、激素調節、環境刺激下的應激反應和病原體抗性等[24].ARF是生長素調節的轉錄因子，在生長素信號傳導途徑中發揮關鍵作用.目前，已有多個物種ARF基因家族成員的數量已被鑒定，但不同物種的ARFs數量存在較大差異.如在擬南芥、水稻、玉米、毛果楊、蘋果、香蕉、甜橙、葡萄、荔枝和桃等植物中分別鑒定得到23、25 、31、39、29、47、19、19、39和18個ARF成員[25-28]，然而，百香果中整個ARF基因家族的系統研究尚未見報道.本研究首次在轉錄組的水平上從百香果中鑒定出13個ARF基因.

保守結構域的鑒定表明，所有的PeARF蛋白均含有保守的B3、Auxin_resp結構域，而CTD結構域僅存在于PeARF6、PeARF3、PeARF12和PeARF13中.CTD是一個介導蛋白質—蛋白質互作的結構域，它可通過ARF-Aux /IAA或ARF-ARF的同源或異源二聚化來調控生長素響應基因的表達.Shen et al[8]研究顯示，在苜蓿的子葉、葉片和莖中，大多數含有CTD結構域的MtARF基因的轉錄本水平明顯的高于其缺失CTD的轉錄本，暗示CTD蛋白結構域可能影響MtARF基因的表達水平.而在本研究中，PeARF1、PeARF2、PeARF3、PeARF4、PeARF5、PeARF7、PeARF9、PeARF10和PeARF11均不含有CTD結構域，其CTD截斷率達69%，明顯的高于大豆(15.68%)、擬南芥(17.39%)、油菜(22.58%)、水稻(24%)和番茄(28.57%)[29]，推測這些缺少CTD結構域的PeARFs可能以一種不依賴生長素的方式進行生長素響應基因的調控.序列比對分析表明，PeARF11、PeARF13蛋白的中間不保守區域富含谷氨酰胺，且二者均與擬南芥轉錄激活因子(AtARF5-AtARF8，AtARF19)屬于同一個分支 ，推測其可能屬于轉錄激活子；而PeARF2、PeARF3、PeARF4、PeARF6、PeARF7、PeARF8、PeARF9、PeARF10、PeARF12等蛋白的中間不保守區域富含絲氨酸，推測其可能屬于轉錄抑制子.此外，所有富含谷氨酰胺的PeARFs蛋白均屬于ClassⅡ，而富含絲氨酸的PeARFs蛋白則存在于ClassⅠ、ClassⅢ和ClassⅣ.因此，通過系統進化也進一步表明，不同的亞家族可能在果實的發育中發揮著不同的作用.

果實發育是細胞分裂，分化和擴增的一個復雜過程，而生長素在此過程中起關鍵作用.本試驗中，研究了PeARFs在‘黃果’和‘紫果’果實4個不同發育階段的表達模式.結果表明，大部分ARF家族成員的表達水平均隨著果實的成熟而下降，僅PeARF11、PeARF12和PeARF13的表達量在果實發育后期有所增加，尤其是PeARF12在果實成熟期的表達水平明顯的高于其它基因.如ClassⅠ中的PeARF6、PeARF8；ClassⅢ中的PeARF7以及ClassⅣ中的PeARF1、PeARF10在兩品種中的表達量均于幼果期較高，隨著果實的發育其表達量逐漸下降，至成熟期降至最低；而ClassⅢ中的PeARF4，ClassⅣ中的PeARF5、PeARF9在‘黃果’中的表達量僅于綠果期和轉色期略有增加，隨后迅速下降，但在‘紫果’中的表達量持續下降.相似的表達趨勢也出現在桃[27]、葡萄[30]、西紅柿[31]和西瓜[32]等果樹上，其中桃果實中的PpARF11、PpARF13；葡萄果實中的VvARF3、VvARF5 、VvARF15以及西紅柿果實中的SlARF1/SlARF2 /SlARF4 /SlARF7/SlARF8 /SlARF11/SlARF14在果實成熟過程中均呈下降趨勢，而西瓜果實中的ClARF8、ClARF5、ClARF13在西瓜授粉13 d后其表達量逐漸增加，尤其是ClARF8在果實成熟期時表達量達最高值.這些結果暗示著部分ARF基因在植物的生長發育，尤其是果實的成熟中發揮著重要的調控作用.此外，PeARF3在兩品種的所有發育時期表達極低甚至不表達，并不是因特定的發育時期或品種而表現出來，這可能是由于PeARF3具有組織特異性或者在百香果ARF基因的擴張進化中產生了無功能的假基因.擬南芥作為一種模式植物，根據AtARF1/AtARF2的功能推測其同源基因PeARF2/PeARF12可能參與百香果的種子、葉片和花器官的發育[9]；PeARF13的功能可能是調控百香果葉片中維管組織的形成以及胚軸的發育[33]；PeARF11可能參與了百香果中側根的形成[12]；PeARF4/PeARF7可能與百香果中雌蕊的發育相關[34]；PeARF5/PeARF9/PeARF10可能調控著百香果根冠的形成以及側根的向地性[35]；而PeARF1可能參與百香果花粉壁的形成[36].

本研究基于轉錄組數據從百香果中鑒定出13個ARF基因，并對其編碼蛋白的理化性質、保守結構域、保守基序和系統進化進行了詳細的生物信息學分析；同時比較了它們在‘黃果’和‘紫果’不同果實成熟階段的表達差異，為進一步了解百香果ARF基因家族成員的結構與功能的關系、揭示其在果實成熟過程中的作用奠定基礎.然而，百香果ARF生長素響應因子的功能驗證以及它是如何響應激素信號調控果實的成熟還需要今后進行深入的研究.