四季梔子的生物學特性及親緣關系

王一帆, 張曉華, 陳清海, 蘇寶川, 連其祥, 鄒雙全, 孫維紅, 邱夢媛

(1.福建農林大學林學院，福建 福州 350002；2.自然生物資源保育利用福建高校工程技術研究中心，福建福州 350002；3.泉州市林業局，福建 泉州 362000；4.壽寧縣林業局種苗站，福建 壽寧 355500)

梔子(GardeniajasminoidesEllis)為茜草科(Rubiaceae)梔子屬(Gardenia)常綠灌木，是極具潛力的觀賞及經濟價值植物，同時也是列入國家植物新品種權保護與審定主要林木品種目錄的物種.目前關于梔子的研究主要集中于化學成分提取及藥理作用方面[1]，同時對梔子培育管理方面也進行了相關研究[2]，但未查閱到有關梔子品種的《植物新品種DUS測試指南》，缺少具體的等級劃分范圍和級差，這在一定程度上影響了梔子新品種的選育工作.2017年中國園林網報道了一種浙江梔子新品種——‘梔香富潤’，其枝型緊湊，葉小、花量多、不結果、味香甜，有枝條生長就有花苞，花期長達180 d以上，從5月中旬開至11月底，在大棚暖房內的花期可達250 d以上[3].目前，還沒有關于福建梔子新品種的報道.

植物新品種鑒定的基本原則是：品種具有特異性、一致性和穩定性[4].目前關于品種鑒定常用的方法有形態學鑒定法、生化鑒定法和分子標記法[5].形態學鑒定是通過植物的外部特征來區分不同的植物[6]，如植株葉片大小、葉片顏色、花瓣數、萼片數、果實顏色等.根據表型性狀來檢測遺傳多樣性是最為直接和簡便易行的方法，這種方法具有簡便、經濟和高效等特點[7]，是專家學者們在植物種質資源鑒定及育種材料的選擇上廣泛運用的一種重要方法.目前，已有采用形態學方法鑒別梔子的研究[8]，但形態學鑒定易受環境因素和植物不同發育時期的影響，存在一定的局限性，不能真實反映遺傳變異.而分子標記是以個體間堿基水平的差異作為依據[9]，能克服形態標記的缺點，因此是研究物種、種間和種內遺傳多樣性及品種間親緣關系鑒定的有效方法.目前對于梔子親緣關系的研究主要采用隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術[10]和簡單重復序列間擴增(ISSR)技術[11]，但尚未見單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)用于梔子研究的報道.SNP與其他分子標記相比具有更多的優點，如SNP在基因組中分布廣、數量多、穩定性強，具有二態性和等位基因，可通過測序直接進行不同個體間的序列對比[12-13].

2014年本課題組于福建省清流縣發現一種常年開花的梔子新資源，其花期長達286 d以上，暫定植物名為四季梔子.目前，國內外還沒有關于四季梔子的研究，為了驗證四季梔子是否為本地梔子變異種的猜想，以及與‘梔香富潤’的區別，本研究對四季梔子的生物學特性以及與相近種的親緣關系進行了分析，希望能為區別不同梔子資源提供理論支持，也為梔子優良性狀的挖掘開發提供參考，這對促進福建梔子新品種選育及具有自主知識產權的鄉土藥用和觀賞植物的開發具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗材料為清流10多年生四季梔子母株、2年生四季梔子扦插植株、清流梔子和浙江梔子‘梔香富潤’.

試驗地位于清流縣南部(北緯25°50′42″，東經116°47′50″)，地處中低緯度，四季分明，屬亞熱帶季風氣候，晝夜溫差大, 年平均氣溫16.5～18.0 ℃，1月份平均氣溫5.2～5.7 ℃，極端最低氣溫-12.8 ℃，7月份平均氣溫27.1～28.1 ℃， 極端最高氣溫39.9 ℃，年降水量1 700～2 000 mm， 無霜期230～280 d，年日照時數1 720～1 745 h[14].該區秋冬季多西北風，春夏季多東南風，全年溫暖濕潤；土壤類型屬于粗骨性紅壤，pH 4.56，含0.82 g·kg-1全磷、3.60 μg·mL-1全鉀、134 g·kg-1堿解氮、10.79 mg·kg-1有效磷、133 μg·kg-1速效鉀，土壤基礎肥力較低.

1.2 方法

1.2.1 生物學特性和表型的觀測 于2017年10月至2018年12月，以四季梔子、清流梔子和‘梔香富潤’為研究材料，選擇具有代表性的植株各3株，包括1株四季梔子母株和2株四季梔子扦插植株，共9株，分別掛牌，統一編號，期間于每月中旬記錄掛果數、開花量、開花期、抽梢期和掛果期，觀測葉片和花的表型性狀，包括葉色、葉長、葉寬、花朵形態、葉柄長度、節間距等.

于2018年9月，從9株梔子上各選取20片當年生生長良好、無病蟲害的健康葉片，拍照并記錄葉片的顏色和形狀.用葉面積掃描儀測量葉面積、葉長和葉寬等指標(精確到0.1 cm)，用游標卡尺測量葉柄長度(精確到0.01 cm).

1.2.2 SNP分子標記的測序 采集9株梔子當年生健康無病蟲害的新生嫩葉[15]，采用改良后的CTAB法[16]提取基因組DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的DNA采用簡化的基因組測序技術(genotyping-by-sequencing, GBS)構建基因文庫.文庫構建時采用內切酶ApeKⅠ(ApeKⅠ的酶切識別位點為CWGC，其中，W指A和T的簡并堿基)對基因組DNA進行酶切.GBS 建庫流程：(1)利用ApeKⅠ限制性內切酶消化基因組DNA；(2)酶切后加入特異設計的P1標簽接頭和P2常規接頭進行連接反應，接頭連接后用Qubit熒光定量儀對各樣本進行定量；(3)將9個樣本的DNA等量混合后純化產物；(4)不同長度序列的PCR擴增效率不同，通過PCR擴增后，片段大小集中在180～480 bp；(5)文庫純化，并進行質檢，合格后上機測序.

1.3 數據處理

1.3.1 物候期觀察統計 統計開花期、抽梢期和掛果期，并記錄期間的開花量和掛果數，用Excel 2016軟件整理.開花期：記錄每株梔子從第一朵花開放到最后一朵花開畢的日期.抽梢期：記錄從葉芽抽新梢到封頂形成休眠芽的日期.掛果期：記錄從開始坐果到果實進入完熟期的日期.

1.3.2 葉表型數據處理 葉表型的所有原始數據(葉色、葉面積、葉長、葉寬)用Excel 2016軟件整理，SPSS 18.0軟件進行主成分和聚類分析.本研究選用標準差對數據進行標準化，在此基礎上作進一步分析.為探討不同種質間表型性狀的整體相似性，采用Q型聚類法和類平均鏈鎖法，距離為歐式距離，構建樹狀聚類圖.

1.3.3 SNP標記數據處理 SNP分子標記測序得到的原始數據可能包含低質量序列和接頭序列等.為了保證信息分析結果的可靠性，需要進行一系列數據處理來過濾原始數據，得到干凈數據.具體步驟如下：(1)去除原始數據中序列5′端未包含樣本標簽(4～8 bp)信息的測序片段(一個樣本對應一個標簽)；(2)將上述片段剪切掉5′端標簽后，進行酶切識別位點的過濾，如果剪切掉標簽的片段5′端未含酶切識別位點，則去除該片段；(3)拆分后的數據去除含接頭的片段；(4)拆分后的數據去除含低質量的片段(質量值≤15的堿基數占整條測序片段的40%以上)；(5)拆分后的數據去除含N(表示無法確定堿基信息)比例>10%的片段.

通過以上步驟得到干凈數據，從中篩選出適合的SNP序列，并使用Treebest NJ軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 四季梔子與其他梔子的生物學特性和表型特征比較

2.1.1 四季梔子的特異性 特異性指通過長期選育的品種與原生種具有明顯區別，如果一個品種的性狀差異恒定且明顯，則認為該品種具有明顯差異[17].通過比較四季梔子與清流梔子兩份種質資源的表型特征和物候期(表1、圖1)得出以下結果.(1)花期：四季梔子扦插植株與清流梔子的花期差異明顯，清流梔子花期在5—8月，四季梔子扦插植株花期在3—12月，四季梔子母株的花期長達12個月；(2)掛果期：四季梔子掛果期為10—12月，清流梔子的掛果期為8—10月；(3)抽梢期：四季梔子全年抽梢，清流梔子抽梢期為3—7月；(4)花的形態特征：四季梔子具有單瓣和重瓣花，清流梔子的花朵僅為單瓣；(5)葉在枝條上的著生方式：四季梔子的葉為3葉輪生，清流梔子的葉為對生.綜上，四季梔子與清流梔子相比具有明顯的特異性.

圖1 不同梔子材料的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of different gardenia materials

表1 試驗材料的編號、來源、表型特征和物候期Table 1 Number, origin and phenotypic characteristics of the experimental materials

2.1.2 四季梔子的一致性和穩定性 一致性是指新品種經過繁殖，其子代除可以預見的變異外，其相關的特征或者特性保持一致[17].穩定性是指新品種經過反復繁殖后或者在特定繁殖周期結束時，其相關的特征或者特性保持不變[18].在兩個測試周期內，分別對四季梔子扦插繁育子代的花和葉片的表現性狀及花期等多個性狀進行統計.結果(表2)顯示：各扦插植株開花量為5.67～6.15朵，差異不顯著；花瓣長寬比為1.6～1.9，花期286～317 d，葉長4.7～4.9 cm，葉寬2.1～2.3 cm，各植株的花期均不小于286 d.各性狀的變異系數為1.66%～7.64%，均小于10%，表明四季梔子扦插繁育子代表型差異的幅度小.可見，四季梔子經過無性繁育，其后代的表型性狀具備一致性和穩定性.

表2 四季梔子扦插植株的性狀Table 2 Traits of four-season gardenia cuttings

2.2 梔子葉表型標記

2.2.1 梔子葉表型的變異特征 對四季梔子、清流梔子和‘梔香富潤’的葉面積、葉長、葉寬、葉片長寬比、節間距和葉柄長度 6個性狀進行描述性統計.結果(表3)顯示，不同梔子材料表型性狀的變異系數為15.93%～89.42%，表明群體間的表型性狀差異幅度大.葉柄長度為0.20～2.39 cm，變異系數達到89.42%，節間距為0.56～7.10 cm，變異系數達到61.11%，表明群體間的葉柄長度和節間距差異顯著；葉面積為8.46～14.98 cm2，變異系數達到21.67% ，表明群體間的葉片大小差異明顯；葉長、葉寬和葉面積的變異系數明顯大于葉片長寬比的變異系數，表明雖然群體間的葉片大小存在差異，但葉形較為穩定.

表3 試驗材料的表型性狀Table 3 Phenotypic traits of the experimental materials

2.2.2 梔子葉的表型特征 主成分分析可以較準確地反映梔子的表型特征，主成分的特征值和貢獻率是選擇主成分的依據，其各變量的特征值越大，則表明此成分的貢獻率越大[19].分析結果(表4)表明，通過主成分分析共提取2個主成分，性狀特征值分別為3.516和1.335，均大于1，主成分2的累計貢獻率為80.8379%(≥70%).其中，主成分1主要是反映梔子生長情況的指標，以葉長和葉片長寬比為主分量；主成分2是反映葉柄長度形態的指標.表明葉長、葉片長寬比和葉柄長度3個性狀對梔子的表型分類比較重要，其余性狀的貢獻率較低.

表4 兩個主成分的負荷量、特征值、貢獻率和累計貢獻率Table 4 Factor loading, eigen value, contribution rate and cumulative contribution rate of the 2 principal components

2.3 梔子的SNP標記

SNP指的是由單個核苷酸——A、T、C、G的改變而引起的DNA序列的改變，造成物種之間基因組的多樣性.為揭示四季梔子單核苷酸變異的信息，應用Stacks軟件對SNP位點進行統計分析.結果(表5)顯示：9個樣本測得的SNP總數以雜合型SNP為主，雜合率>50%，只有QS-2和QS-3純合型較多，分別占60.12%、69.23%；SNP總數最大的是QL-1，為179 653個，其次是ZJ-2，為15 660個，QS-2的總數最小，為23 514個；雜合型SNP占SNP總數比例最高的是ZJ-2，達到86.24%，比例最低的是QL-3，為30.77%.

表5 試驗材料SNP結果的統計表Table 5 Statistics on the SNP results of the experimental materials

2.4 梔子的聚類分析

圖2b表明，當標尺值為20時，基于葉表型性狀的聚類結果可以將9個不同來源的梔子分為Ⅰ和Ⅱ類兩大類.Ⅰ類為清流梔子(QL-1、QL-2、QL-3)，Ⅱ類為浙江采集的‘梔香富潤’(ZJ-1、ZJ-2、ZJ-3)和清流采集的四季梔子(QS-1、QS-2、QS-3)，基于葉表型的Q型聚類能將浙江和清流采集的種質給區分開.基于SNP位點的聚類也能將浙江和清流采集的種質區分開(圖2a)，然而與基于葉表型的聚類結果(圖2b)不同的是，QL-3與QL-1、QL-2并不是如圖2b所示的分開聚為一小類，而是QL-3位于QS-1和QS-3之外，單獨聚為一支；而QS-2則是位于QL-1和QL-2之外，單獨聚為一支.

a：基于SNP位點的樹狀聚類圖；b：基于葉表型Q型聚類分析的樹狀聚類圖.圖2 不同梔子材料種間的親緣關系Fig.2 Phylogenetic map of different gardenia materials

3 討論與結論

本研究鑒定了四季梔子是否具有特異性、一致性和穩定性，結果表明，四季梔子與清流梔子在花的形態特征、花期、掛果期和抽梢期等方面存在明顯差異.其中，花期差異最大，四季梔子的花期長達286～317 d，與清流梔子60 d左右的花期相比，花期長度的特異性極其顯著，表明四季梔子具備品種特異性.四季梔子無性系子代與母株的表型和生物學特性無明顯差異，花朵均為白色單瓣花，偶爾出現重瓣花.初步認定四季梔子具備植物新品種的一致性和穩定性，是極具開發應用的新資源.

本研究對9個樣本中差異較為明顯的葉表型進行分析的結果顯示，樣本各性狀指標的變異系數為15.93%～89.42% ，表明樣本內表型差異的幅度大.葉柄長度的變異系數最大(89.42%)，葉片長寬比的變異系數最小(15.93%)，表明葉形較為穩定.從6個葉表型性狀中提取2個主成分，性狀的特征值均大于1，主成分2的累計貢獻率為80.838%(≥70%).反映了葉長、葉片長寬比和葉柄長度3個性狀對梔子的表型分類比較重要.

表型聚類能夠將清流的本地種、四季梔子和浙江采集的‘梔香富潤’區分開來.在基于SNP位點的聚類圖中，浙江和清流兩地的種質被清楚地區分開，而清流梔子和四季梔子并不像表型聚類圖那樣被明顯地區分開，表明清流本地野生梔子與四季梔子具有更近的親源關系.兩種聚類結果的差異，表明表型鑒定對親緣關系的鑒定具有一定的參考價值，但表型性狀易受到植物生境等多方面的影響產生變異.

綜上，初步認定四季梔子具有特異性、一致性和穩定性，且相對于‘梔香富潤’，與清流梔子的親緣關系更近，初步推定為清流當地梔子變種.本研究在基于前人研究的基礎上，對四季梔子和清流梔子的12個數量性狀進行了測定，對梔子新品種測試具有一定的指導意義，但因栽培條件、年份、品種內變異、氣候環境變化等因素存在的不確定性，應將大量的年度間數據進行集中分析，同時選擇穩定且具有典型性狀特征的標準品種作為參照，對年度間的數據進行校對和修訂，從而確保品種測試的客觀性與合理性.