堿性成纖維細胞生長因子調節(jié)小鼠慢性移植物抗宿主病的作用及其機制

劉一嵐，帥燕蓉，鄧 銳，何光翠，繆曉娟，范方毅

（解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院血液科，四川 成都 610038）

異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）是部分遺傳性疾病或血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的主要方式，其可使患者后期出現(xiàn)慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）并發(fā)癥，對患者生活質量造成影響，嚴重者可導致非復發(fā)死亡[1]。近年來移植供應源主要為外周血干細胞和非血緣供者，加之受者年齡上限提高，cGVHD 發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2，3]，因此明確cGVHD 發(fā)病機制尤為重要。隨著發(fā)病機制研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)B 細胞受體相關的信號通路和B 淋巴細胞活化與cGVHD 相關，間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是與之相關的治療方法，其為一群多功能細胞，具有多向分化潛能和自我更新能力，在造血干細胞移植后具有調節(jié)免疫級組織修復作用，其作用機制尚不完全明確，但可知與調節(jié)性T 細胞和B 細胞有關。目前MSC 來源主要為骨髓或臍帶血體外傳代培養(yǎng)，具有一定臨床療效，但需要經(jīng)過多次輸注[4，5]。堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）也為多功能因子，在增殖MSC 方面具有關鍵作用[6]。本研究通過建立單倍體HSCT 后cGVHD 的小鼠模型，分析bFGF 調節(jié)小鼠cGVHD的作用及其機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 建立單倍體HSCT 后cGVHD 的小鼠模型 購買8～10 周齡雌性C57BL/6 共36 只，實驗分組：空白對照組、外源性MSC 治療組和bFGF 治療組，每組12只。所有動物均在無菌恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)。各組老鼠均給予Co605.5 Gy 全身照射的預處理，其次經(jīng)腹腔輸注供體小鼠10×107個脾細胞/只，空白對照組輸注0.5 ml RPMI1640 培養(yǎng)液。

1.2 流式細胞術cGVHD 相關免疫細胞檢測 將獲得的淋巴細胞濃度調1×105/100 μl，吸取100 μl 細胞懸液至流式檢測管中行抗體孵化，調節(jié)性T 細胞表型以CD4、CD25 標記，4 ℃條件下孵化30 min。孵化完畢后樣品給予PBS 清洗以去除多余抗體，重懸于200 μl PBS 液中上機檢測，細胞收獲總數(shù)為1×105，收獲速度200～300 cells/s，數(shù)據(jù)由FlowJo7.6 軟件分析完成。

1.3 ELISA 酶聯(lián)免疫細胞因子檢測 血漿層稀釋2～5倍。包被：用0.05 mol/L PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10 μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1 ml，4 ℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3 次，3 min/次。加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml 于上述已包被之反應孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌，同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。加酶標抗體：于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌。加底物液顯色：各反應孔中加入臨時配制的TMB 底物溶液0.1 ml，37 ℃10 min。終止反應：于各反應孔中加入2 mol/L 硫酸0.05 ml。結果判定：測O·D 值：在ELISA 檢測儀上，于450 nm（若以ABTS 顯色，則410 nm）處，以空白對照孔調零后測各孔O·D 值，計出相應因子（IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α）濃度。

1.4 觀察指標 比較三組cGVHD 臨床表現(xiàn)和小鼠生存情況、CD4+和CD25+細胞，并觀察間充質干細胞培養(yǎng)結果。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 軟件包進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以以（）表示，采用方差分析或t檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠生存情況 空白對照組移植后10 d 小鼠開始死亡，17 d 內小鼠全部死亡；對照組移植后13 d小鼠開始死亡，19 d 內小鼠全部死亡；實驗組移植后15 d 小鼠開始死亡，其中2 只小鼠生存時間超過30 d。實驗組小鼠生存時間多于空白對照組和對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 三組cGVHD 臨床癥狀比較 空白對照組出現(xiàn)上述癥狀于小鼠移植后8 d；對照組出現(xiàn)上述癥狀于小鼠移植后8 d；實驗組出現(xiàn)上述癥狀于小鼠移植后10 d。實驗組cGVHD 臨床癥狀出現(xiàn)時間晚于對照組和空白對照組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 三組cGVHD 白細胞計數(shù)比較 三組移植后3 d白細胞計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；三組移植后6、9、12、14、15 d 白細胞計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組和實驗組移植后下降速度較慢，空白對照組白細胞計數(shù)下降速度較快，且移植后15 d 白細胞計數(shù)仍＞0.5×109/L，見表1。

2.4 三組cGVHD 體重減輕情況比較 移植后7 d，空白對照組體重減輕程度高于對照組和實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；移植后14 d，空白對照組、對照組體重減輕程度與對照組體重減輕程度高于實驗組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但空白對照組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.5 三組IL-10、IL-12、TNF-β 和TNF-α 比較 對照組TNF-α、TNF-β 與實驗組比較，空白對照組TNFα 與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗組IL-10 和IL-12 均高于空白對照組和對照組，TNF-α 高于空白對照組，TNF-β 低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

2.6 三組CD4+和CD25+細胞比較 實驗組CD4+和CD25+細胞水平高于空白對照組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

2.7 間充質干細胞培養(yǎng) 間充質干細胞培養(yǎng)結果顯示，移植后14 d，對照組和空白對照組細胞無法集落和繼續(xù)生長，而實驗組可見大量細胞集落且良好生長，光鏡下見細胞呈長梭狀且貼壁，細胞核緊密團結，見圖1。

3 討論

cGVHD 為HSCT 治療后嚴重并發(fā)癥，其對患者生命和健康造成較大威脅，如何預防和治療cGVHD成為臨床研究熱點和重要課題[7]。目前，細胞療法為預防和治療cGVHD 常用方法，其中MSC 最受關注。研究證實[8]，MSC 因對免疫功能和造血細胞增殖、分化及成熟具有調節(jié)作用，可有效預防急性移植物抗宿主病（aGVHD），但是否對cGVHD 有效尚不可知。另研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，MSC 可以抑制混合淋巴細胞反應絲裂原，升高CD8+和CD28-調節(jié)性T 細胞亞群比例，促進CD5+調節(jié)性B 細胞增殖且抑制其凋亡，提高IL-10 分泌水平，降低血清B 細胞表面受體的表達和B 細胞激活因子（BAFF）水平，誘導免疫耐受。李瀟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)性B 細胞在cGVHD 的發(fā)病中起重要作用。bFGF 為廣譜的有絲分裂原，對血管內皮細胞、上皮細胞、成骨細胞、成肌細胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層細胞的增殖分化起刺激和調節(jié)作用[13，14]，還可促進血管生成和神經(jīng)細胞修復，協(xié)同其他造血生長因子共同促進造血細胞體外克隆形成。

表1 三組cGVHD 白細胞計數(shù)比較（，×109/L）

表1 三組cGVHD 白細胞計數(shù)比較（，×109/L）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與實驗組比較，bP＜0.05

表2 三組cGVHD 體重減輕情況比較（，g）

表2 三組cGVHD 體重減輕情況比較（，g）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與實驗組相比，bP＜0.05

表3 三組IL-10、IL-12、TGF-β 和TNF-α 比較（）

表3 三組IL-10、IL-12、TGF-β 和TNF-α 比較（）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與實驗組相比，bP＜0.05

表4 三組CD4+和CD25+細胞比較（，%）

表4 三組CD4+和CD25+細胞比較（，%）

注：與對照組相比，aP＜0.05；與實驗組相比，bP＜0.05

圖1 經(jīng)bFGF 處理的小鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng)結果

本研究通過建立單倍體HSCT 后cGVHD 的小鼠模型，將實驗分為空白對照組、對照組（外源性MSC 治療組）和實驗組（bFGF 治療組）并觀察各組小鼠生存情況和cGVHD 臨床表現(xiàn)，結果發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠生存時間多于空白對照組和對照組，cGVHD臨床癥狀出現(xiàn)時間晚于對照組和空白對照組，對照組和實驗組移植后下降速度較慢，空白對照組白細胞計數(shù)下降速度較快，且移植后15 d 時白細胞計數(shù)仍＞0.5×109/L，提示注射適量bFGF 對cGVHD 發(fā)生起一定延緩作用，對cGVHD 臨床癥狀發(fā)生起明顯減輕作用，可延長小鼠的生存時間，減少預處理的損害[15-17]。此外，本研究通過對MSC 培養(yǎng)檢測，結果發(fā)現(xiàn)移植后實驗組見大量細胞集落且良好生長，光鏡下見細胞呈長梭狀且貼壁，細胞核緊密團結，說明實驗組培養(yǎng)的細胞為MSC，具備較強的誘導分化能力。本研究發(fā)現(xiàn)實驗組CD4+和CD25+細胞水平高于空白對照組和對照組，實驗組IL-10 和IL-12 均高于空白對照組和對照組，TNF-α 高于空白對照組，TNF-β 低于空白對照組（P＜0.05），提示bFGF 通過增加CD4+和CD25+細胞調節(jié)性T 細胞分泌、促進IL-10、IL-12 和TNF-α 分泌和減少TNF-β 分泌，從而對GVHD 發(fā)生起延緩作用，證實bFGF 可延緩GVHD 發(fā)生時間，穩(wěn)定造血微環(huán)境，減輕預處理的損傷作用，延長小鼠的生存時間，減輕GVHD 嚴重程度，促進MSC 體內增殖和活性[18-20]。

綜上所述，bFGF 對cGVHD 具有調節(jié)作用，其通過促進單倍體HSCT 供者來源的間充質干細胞體內增殖，使調節(jié)性T 細胞、調節(jié)性B 細胞和骨髓來源的抑制細胞增殖，從而調節(jié)cGVHD，延緩其發(fā)生。