甘草苷體內暴露特征及體外跨膜轉運機制研究

張愛杰，李 偲，劉羽康，張英華，谷偉玲，董世奇*，樊慧蓉*，谷 元，司端運

甘草苷體內暴露特征及體外跨膜轉運機制研究

張愛杰1, 2，李 偲3，劉羽康3，張英華4，谷偉玲4，董世奇1, 2*，樊慧蓉1, 2*，谷 元5，司端運5

1. 中國醫學科學院放射醫學研究所，天津 300192 2. 中國醫學科學院創新藥物放射性藥代研究重點實驗室，天津 300192 3. 天津中醫藥大學，天津 301617 4. 吉林省中醫藥科學院，吉林 長春 132012 5. 天津藥物研究院，天津 300462

總甘草素是甘草苷在體內的主要暴露形式，對兩者在大鼠體內暴露特征及體外跨膜轉運機制進行研究，為以甘草苷單體為新藥的進一步開發提供依據。采用LC-MS/MS分析方法測定大鼠給藥后不同時間點血漿樣品中的總甘草素濃度，并應用WinNonlin.6.3軟件采用非房室模型的統計矩法計算藥代動力學參數；同時測定大鼠ig給藥后組織勻漿中的濃度，考察不同類型甘草素在各組織中的暴露特征；應用體外MDCK-MDR1細胞模型，研究甘草苷、甘草素的跨膜轉運能力及其機制。ig給藥后在大鼠體內，甘草苷不呈線性動力學特征；血漿和大部分組織中主要以甘草素的II相結合產物存在，肝、子宮、卵巢、胃和腸組織中主要為游離甘草素；總甘草素暴露量排序為腸＞血漿＞肝＞腎＞肺＞胃＞子宮＞卵巢＞脂肪＞心＞脾＞肌肉＞睪丸，且不易產生組織蓄積現象；甘草素跨膜轉運能力較甘草苷良好，且均不是P-gp轉運體的底物。甘草苷不呈線性動力學吸收特征；甘草素在組織中暴露特征表現為不同組織中甘草素的存在形式和分布程度差異較大，總甘草素不易產生組織蓄積現象；兩者均為被動擴散跨膜轉運方式。

甘草苷；甘草素；暴露特征；吸收動力學；組織分布；跨膜轉運機制

甘草為豆科植物甘草Fisch.、脹果甘草Bat. 及光果甘草L.的干燥根及根莖；其性味甘平，歸心、肺、脾、胃經，具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥的功效[1]。甘草的現代藥理研究顯示其具有抗炎、抗菌、保肝、抗氧化、抗癌、降糖、免疫調節等多種藥理作用[2-3]。甘草的主要活性成分有三萜類、黃酮類、多糖類[4]，具有廣泛的生物活性。目前，甘草屬中分離得到的黃酮類化合物及其衍生物有300多種[5]，具有抗菌、抗病毒、保肝、抗腫瘤等藥理作用。甘草苷是甘草中主要的黃酮類化合物，本課題組前期研究發現大鼠單次ig 30、100 mg/kg甘草苷后具有顯著的抗垂體后葉素誘導的心肌缺血作用，表現為抑制心電圖J點變化。因此，甘草苷擬作為抗心肌缺血Ⅰ類新藥進行開發研究。

通過藥物代謝和藥動學研究藥物的體內處置和動力學過程，將藥物在血循環和靶器官的暴露水平與關鍵的臨床表現（藥效和不良反應）相關聯，為了解動物或人體服用藥物后的生物學和物理化學過程及機制提供科學依據[6]。已有文獻報道提示，甘草素是甘草苷在體內的代謝產物之一，甘草苷進入體內主要是以甘草素的形式被吸收[7-10]。為了確定甘草苷經口給藥后在體內的主要暴露形式，本研究首先進行了一系列預實驗。結合藥效學的給藥方式和有效劑量，大鼠單次ig給予30 mg/kg甘草苷后大鼠血漿中檢測到少量甘草苷（最高血藥濃度約為50 ng/mL），而血漿中總甘草素平均最高濃度為（3.166±1.616）μg/mL，研究結果提示甘草苷原型不是甘草苷胃腸道給藥后在體內的主要存在形式[10]，同時血漿中總甘草素（包括游離甘草素、甘草素硫酸結合物、甘草素葡萄糖醛酸結合物）的暴露量遠遠大于游離甘草素的暴露量。吸收和分布是藥物進入機體到達作用部位的重要過程，藥物吸收的多少及快慢直接影響到藥物在體內發揮的作用[11]。其中藥物的吸收過程與轉運密切相關，且甘草有“解百藥毒”的特性[12]，其機制之一為延緩和減少藥物吸收，目前也有研究表明甘草這一特性與其跨膜轉運功能有關[13]。基于此，本研究以含有葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶的H-2型水解酶，測定未經水解及酶水解后樣品中甘草素的含量表征游離甘草素和總甘草素，定量分析兩者在大鼠體內的吸收動力學、組織分布速度和程度及消除特點，總結歸納暴露特征，從而間接表征甘草苷在大鼠體內的動態變化；以甘草苷和甘草素為待測物分別評價其跨膜轉運能力、探究跨膜轉運機制等，為甘草苷的進一步研究開發提供參考數據。

1 材料

1.1 藥品與試劑

甘草苷（批號20121211，質量分數為98.23%）、甘草素（批號20120401，質量分數為100%），吉林省中醫藥科學院；柚皮素（批號071100023，質量分數為99.2%），河南天方藥業有限公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）、-甲基-吡咯烷酮（分析純）、甲酸（色譜純）、甲酸銨（分析純），天津市光復精細化工研究所；無水乙醇（分析純），天津市化學試劑供銷公司；甲醇（色譜純）、冰乙酸（色譜純），天津康科德科技有限公司；β-葡萄糖醛酸酶（Type H-2 From Helix Pomatia，批號011M7405），SIGMA-ALDRICH公司；磷酸二氫銨（分析純），天津市化學試劑三廠；肝素鈉注射液（批號20111006），天津市生物化學制藥廠；DMEM培養基（批號NYM1045），美國Hyclone公司，使用前4 ℃保存；胎牛血清（批號1227693），美國Gibco公司，使用前?25 ℃保存；Trypsin-EDTA（批號1155732），美國Gibco公司，使用前4 ℃保存；超純水，實驗室自制。

1.2 實驗動物

SPF級健康Wistar大鼠，雌雄各半，7～10周齡，體質量200～300 g。北京市維通利華實驗動物科技有限公司提供，生產單位許可證編號：SCXK（京）2012-0001，動物質量合格證編號：No.11400700015112、No.11400700018465。本研究的動物使用方案已經獲得天津市新藥安全評價研究中心IACUC批準，IACUC號為2013071901。

1.3 儀器

液相色譜系統（配備LC-20AD型輸液泵、DGU-20A3型脫氣機、CTO-20A型柱溫箱、SI L-20A型自動進樣器、CBM-20A系統控制），日本Shimadzu公司；Diamonsil?C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Dikma科技公司；質譜系統（配備API 4000 Q-TRAP質譜儀，ESI（電噴霧離子化）離子化源和Analyst 1.5.2分析數據處理系統工作站），美國Applied Biosystems公司；17R臺式高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；Turbo Vap LV型樣品濃縮儀，美國Caliper公司；700E型全自動均質器，美國TOMTEC公司；BM-40型純水制備系統，北京中盛茂源科技發展有限公司；Eppendorf手動單道加樣器，德國Eppendorf公司；ZHWY-110X50型恒溫水浴震蕩儀，上海智城分析儀器制造有限公司；IMS-40全自動雪花制冰機制冰機，常熟市雪科電器有限公司；Olympus- CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；二氧化碳培養箱，美國Thermo公司；Millcell ERS-2跨上皮電阻儀，美國Millipore公司；12孔聚碳酸酯膜轉運（Transwell?），美國Corning公司；單人超凈工作臺及生物安全柜，力康生物醫療有限科技公司。

2 方法

2.1 LC-MS/MS條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil?C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動相為甲醇（A）-0.5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.2%甲酸和10%甲醇，B）（52.5∶47.5）；體積流量0.6 mL/min；進樣體積為3 μL；運行時間為10 min（5～9.8 min切換進入質譜）。

2.1.2 質譜條件 ESI電噴霧離子源，離子噴霧電壓?3000 V；溫度500 ℃；噴霧氣344.74 kPa（50 psi）；加熱氣551.60 kPa（80 psi）；卷簾氣68.95 kPa（10 psi）；碰撞氣55.16 kPa（8 psi）；負離子方式檢測，掃描模式為多反應監測（MRM）；甘草素碰撞能量為?40 V，內標物柚皮素碰撞能量為?25 V；甘草素/為255.0～119.0；內標物柚皮素/為271.0～151.0。

2.2 吸收動力學

2.2.1 給藥溶液的配制 單次ig給藥：準確稱量甘草苷120、240、480 mg，在乳缽中研磨狀態下緩緩加入0.5%羧甲基纖維素鈉20 mL，分別制成6、12、24 mg/mL的藥液。iv給藥：準確稱量甘草苷150 mg，在乳缽中研磨狀態下緩緩加入2 mL-甲基吡咯烷酮，再加1 mL無水乙醇，完全溶解后，加入7 mL生理鹽水，混勻，制成15 mg/mL的藥液。

2.2.2 動物給藥 單次ig給藥：健康Wistar大鼠18只，體質量（245±25）g，雌雄各半，給藥前禁食16 h，實驗期間自由進食與飲水。按30、60、120 mg/kg的劑量單次ig給藥，給藥容積為5 mL/kg，每個劑量組6只。iv給藥：健康Wistar大鼠6只，雌雄各半，體質量（272±40）g，給藥前不禁食，試驗期間自由進食與飲水。按30 mg/kg的劑量經尾iv，給藥容積為2 mL/kg。

2.2.3 血漿樣品的采集 單次ig給藥：單次ig給藥后0.167、0.5、1、2、3、4、6、9、12、17、24、30 h，分別自眼眶后靜脈叢采血200 μL，肝素抗凝， 4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，分離血漿，分裝于EP試管中，?80 ℃冷凍保存。iv給藥：iv給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、12、17、24和30 h，分別自眼眶后靜脈叢采血200 μL，肝素抗凝， 4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，分離血漿，分裝于EP試管中，?80 ℃冷凍保存。

2.2.4 血漿樣品處理與分析 精密吸取50 μL大鼠給藥后的血漿樣品，置于已加入10 μL乙酸工作液（0.56 mol/L）的玻璃管中，輕搖混勻，加入25 μL β-葡萄糖醛酸酶溶液（100 U），渦旋30 s混勻，置于37 ℃恒溫水浴1 h；從水浴中取出后，加入內標柚皮素溶液（2 μg/mL，甲醇配制）50 μL，渦旋30 s混勻，再加入2.5 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，3000 r/min離心10 min（4 ℃）；取上清液2 mL，40 ℃下氮氣吹干，用100 μL 50%甲醇水溶液復溶，12 000 r/min離心5 min（4 ℃），上清進樣3 μL，進行LC-MS/MS分析。

2.2.5 藥動學參數計算 采用WinNonlin 6.3軟件的非房室模型統計矩法計算藥動學參數，其中血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）采用梯形法計算，消除半衰期（1/2）采用Best Fit法計算，5 min時藥物濃度（5min）、峰濃度（max）、達峰時間（max）采用實測值。

2.3 組織分布研究

組織分布實驗采用ig給藥方式（與藥效學實驗一致），研究甘草苷的分布特征。

2.3.1 給藥溶液的配制 精密稱取甘草苷300 mg，加入0.5% 羧甲基纖維素鈉25 mL研勻至混懸，臨用現配，即得質量濃度為12 mg/mL的ig藥液。

2.3.2 動物給藥 健康Wistar大鼠18只，雌雄各半，體質量180～238 g。進行3個時間點（2、6、17 h）的組織分布實驗，每個時間點6只，雌雄各半。給藥前大鼠禁食16 h，給藥后4 h進食，實驗期間自由飲水。按60 mg/kg的劑量ig給藥，給藥容積為5 mL/kg。

2.3.3 生物樣品的采集 分別于給藥后2、6、17 h乙醚吸入麻醉手術剪斷頸動脈取血至肝素化試管中，于10 min內置于離心機中離心（4℃、3000 r/min，離心5 min），分裝于EP試管中，?80℃冷凍保存；取血后乙醚過量麻醉脫頸處死動物，分別剖取腦、肌肉、脂肪、睪丸、卵巢、子宮、肝、脾、腎、肺、心、胃、小腸，純水沖洗，濾紙吸干水分，稱定質量，剪刀剪碎，放入EP試管中。將EP試管置于全自動勻漿機中，按照5 mL/g對應體積加入純水進行勻漿，將各組織勻漿置于?80℃冷凍保存，待測。

2.3.4 組織樣品處理與分析 除臟器組織樣品以大鼠各組織勻漿代替血漿外，其他實驗操作同“2.2.4”項。上述處理過程用于組織樣品中總甘草素濃度的測定。應用于游離甘草素的濃度測定時，不加入乙酸工作液和β-葡萄糖醛酸酶進行孵育，其余處理過程與總甘草素的濃度測定一致。

2.3.5 數據處理

（1）組織含量計算：由LC-MS/MS法測定并經Analyst1.5.2數據處理軟件計算獲得的各組織樣品的質量濃度單位為ng/mL，換算成各組織含量（ng/g）需乘以勻漿體積與各組織質量的比值（5 mL/g），具體公式如下。

組織含量＝組織勻漿測定濃度×5

（2）組織暴露量計算：采用梯形法計算總甘草素和游離甘草素在各組織中的AUC0-17 h，以考察藥物在各組織中的分布程度。

2.4 跨膜轉運機制研究

2.4.1 無血清細胞培養基-多藥耐藥蛋白1（MDCK-MDR1）細胞模型的建立 Madin-Darby canine kidney（MDCK）-MDR1細胞是將人類的MDR1基因轉染到MDCK細胞上產生的[14-15]，多藥耐藥蛋白（MDR1）也稱為P-糖蛋白（P-gp）[16]。MDCK-MDR1細胞廣泛應用于P-gp底物和抑制劑的體外快速篩選研究。該細胞株由日本富士生物醫藥研究所友情贈送。細胞培養方法如下[17]：MDCK-mock和MDCK-MDR1細胞于常規培養皿內，以高糖DMEM培養液（含10% FBS）在37 ℃、5% CO2的培養箱內培養，用含0.25% EDTA的胰酶消化，用新鮮培養液調細胞密度至2×105/mL接種于Transwell聚碳酸酯膜12孔板中（膜面積為1.13 cm2）。在頂端側（AP）每孔加0.5 mL細胞懸液，基底側（BL）每孔加1.5 mL新鮮培養基，每天換液，連續培養6 d，得到完全分化的細胞單層。

本實驗所用MDCK-mock和MDCK-MDR1細胞均為25～30代。

2.4.2 MDCK-mock和MDCK-MDR1單層細胞電阻（TEER）測定 MDCK-mock和MDCK-MDR1細胞接種于Transwell膜上培養6 d；將Millcell ERS-2電阻儀的電極放入含有Hank's平衡鹽溶液（HBSS）的燒杯中，預平衡20 min；移去培養板中的培養液，AP側每孔加預熱的HBSS 0.5 mL，BL側每孔加預熱的HBSS 1.5 mL，37 ℃平衡20 min，洗去細胞表面的雜質；移走HBSS，重新加入預熱的HBSS，測定跨膜電阻值；用1個空白載體重復上述步驟以獲得空白值。

2.4.3 細胞單層的雙向轉運實驗[17]

（1）AP→BL方向的轉運試驗：吸去Transwell小室AP和BL端的培養基，加入37 ℃預熱的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL預熱的含有甘草苷/甘草素的HBSS溶液，BL端加入1.5 mL空白HBSS溶液；37 ℃恒溫振蕩器培養1.0 h，振蕩器轉速為80 r/min；吸取BL端的轉運液，測定轉運液中的甘草苷/甘草素濃度。

（2）BL→AP方向的轉運試驗：吸去Transwell小室AP和BL端的培養基，加入37 ℃預熱的HBSS溶液，37 ℃平衡20 min；吸去HBSS，在AP端加入0.5 mL空白HBSS溶液，BL端加入1.5 mL預熱的含有甘草苷/甘草素的HBSS溶液；37 ℃恒溫振蕩器培養1.0 h，振蕩器轉速為80 r/min；吸取AP端的轉運液，測定轉運液中的甘草苷/甘草素濃度。

2.4.4 數據的處理與分析

（1）TEER的計算：采用TEER值表征細胞間緊密連接的完整性，并按照公式計算。

TEER＝(測定電阻值－空白值)×單層表面積

（2）表觀滲透系數（app）的計算：采用app值的大小表征藥物透過單層細胞的能力和藥物吸收的速度以及程度。研究表明藥物在Caco-2細胞模型的app與藥物人體口服吸收程度相關性良好，且與藥物在MDCK細胞和Caco-2細胞中的滲透性有良好相關性。

app＝d/d×1/×1/0

d為藥物在d時間內的透過量，為膜的表面積，0為初始濃度。

（3）外排率（E）的計算E值的大小反映藥物外排的能力，通過E值可以推測藥物是否為P-糖蛋白的底物。當待測藥物的E≥2時，表明藥物可能為腸道外排轉運體的底物，當E≤0.5時，表示該藥物可能為腸道攝入型轉運蛋白的底物，需要做進一步研究。

E＝app(BL－AP)/app(AP－BL)

3 結果

3.1 吸收動力學

3.1.1 大鼠單次ig給藥的血漿總甘草素濃度-時間曲線 大鼠ig給藥后，3個劑量組動物不同時間平均血漿總甘草素濃度-時間曲線比較見圖1。

3.1.2 大鼠iv給藥的血漿總甘草素濃度-時間數據 在30 mg/kg劑量下大鼠ig與iv給予甘草苷后，不同時間相應的平均血漿總甘草素濃度-時間曲線比較見圖2。

3.1.3 大鼠單次ig、iv后血漿總甘草素藥動學參數比較 大鼠單次ig、iv后血漿總甘草素藥動學參數見表1。在大鼠單次ig甘草苷后，在30～120 mg/kg劑量內，與體內暴露量密切相關的藥動學參數AUC0-30 h、AUC0-∞、max隨劑量增加而增加，增加的比例小于劑量比；與分布、消除過程密切相關的1/2、清除率（CL）、分布表觀容積（d）等參數與給藥劑量不相關，不隨給藥劑量增加而呈明顯變化。上述情況均表明大鼠單次ig甘草苷后，在30～120 mg/kg劑量內不呈線性動力學特征。根據大鼠ig給予甘草苷后總甘草素的AUC0-30 h均值與同劑量下iv給予甘草苷后總甘草素的AUC0-30 h均值進行計算，大鼠ig甘草苷后的絕對生物利用度為80.6%。

3.2 組織分布研究

3.2.1 甘草苷的組織分布特點 大鼠ig 60 mg/kg甘草苷后在2、6、17 h這3個時間點平均總甘草素和游離甘草素在各組織/血漿的分布見表2。對各組織/血漿中總甘草素和游離甘草素含量進行分析比較，結果表明：（1）大鼠ig給予甘草苷后，血漿中2 h和17 h時間點檢測不到游離甘草素，6 h時游離甘草素也非常少，而水解后的總甘草素濃度較高，表明大鼠血漿主要以甘草素的II相結合產物形式存在。（2）大鼠ig給予甘草苷后，各組織中甘草素分布的存在形式和組織暴露量不同，大鼠血漿主要以甘草素的II相結合產物形式存在；脾、子宮、卵巢、肝、胃和腸組織中直接測得游離甘草素的含量與組織樣品經酶水解后測得總甘草素含量相似，提示上述組織中游離甘草素為主要暴露物質；其余組織結合型甘草素與游離甘草素共存。ig給藥后6 h藥效靶器官心組織中總甘草素的含量較游離甘草素高1倍，至給藥后17 h總甘草素與游離甘草素含量相似，且游離甘草素含量下降緩慢，表明結合型甘草素在心組織中可能逐漸全部轉化為游離甘草素。（3）除胃中甘草素的含量在給予甘草苷2 h后最高外，其余組織均在6 h達到分布峰值，之后隨著時間的延長呈迅速下降趨勢。大鼠ig給藥17 h，即約3個半衰期后，大部分組織中已檢測不到甘草素或含量已降至分布峰值的1/10～1/20，表明不會產生組織蓄積趨勢。

圖1 大鼠ig給予3劑量甘草苷后的平均血漿總甘草素濃度- 時間曲線(n= 6)

圖2 大鼠ig與iv給予30 mg/kg甘草苷后平均血漿總甘草素濃度-時間曲線比較 (半對數坐標，n= 6)

表1 大鼠單次ig、iv后總甘草素藥動學參數比較(n= 6)

*= 3

3.2.2 甘草苷的組織分布程度 按“2.3.5”項下方法計算的各組織/血漿中總甘草素和游離甘草素的分布程度AUC0-17 h和游離甘草素占總甘草素的比例（AUCF/AUCT）結果見表3。

表3 大鼠ig給予甘草苷后各組織和血漿中總甘草素和游離甘草素的AUC0-17 h比較

AUCF為游離甘草素的AUC0-17 h；AUCT為總甘草素的AUC0-17 h；*= 3

AUCFis the value of AUC0-17 hfor free liquiritigenin; AUCTis the value of AUC0-17 hfor total aglycone liquiritigenin;*= 3

根據各組織中總甘草素和游離甘草素的組織暴露量AUC0-17 h結果可知，總甘草素分布程度腸＞血漿＞肝＞腎＞肺＞胃＞子宮＞卵巢＞脂肪＞心＞脾＞肌肉＞睪丸；游離甘草素分布程度：腸＞肝＞腎＞胃＞肺＞子宮＞卵巢＞脾＞脂肪＞心＞血漿＞肌肉＞睪丸。總甘草素在腸、肝、腎、胃、肺分布相對較高；在雌性生殖器官卵巢、子宮中的分布相對高于雄性生殖器官睪丸；在心、脾、脂肪、肌肉中分布相對較少；無論結合型的還是游離型甘草素均不能到達腦組織，因此腦中檢測不到甘草素。

3.2.3 總甘草素的組織含量/血漿濃度比 各時間點組織樣品中總甘草素平均含量與同時間點血漿的平均濃度比值見表4。

肺、肝的總甘草素組織/血漿比隨時間變化基本維持一致；肌肉、脾、卵巢、腎、心、胃和腸的總甘草素組織/血漿比隨時間推進迅速增加，結果表明，除肺和肝外，總甘草素在其余組織的消除過程和血漿的消除過程不一致。

表4 組織樣品中總甘草素平均含量與同時間點的平均血漿濃度比值(n= 6)

*= 3

3.3 跨膜轉運機制研究

3.3.1 MDCK-MDR1細胞模型的驗證 MDCK- mock細胞單層的TEER值到第6天達到（245±13）Ω·cm2＞150 Ω·cm2，MDCK-MDR1細胞單層的TEER值到第6天達到（242±10）Ω·cm2＞150 Ω·cm2，表明MDCK-mock和MDCK-MDR1細胞單層的致密性與完整性均良好，符合實驗要求。

3.3.2 甘草苷和甘草素在MDCK-MDR1細胞的雙向轉運 MDCK-MDR1細胞模型，甘草苷5 μmol/L給藥，甘草素10 μmol/L給藥，得到的雙向轉運app和E值，見表5。

本研究中甘草苷在MDCK-MDR1細胞模型攝入方向的app約為2×10?6cm/s，說明甘草苷跨膜轉運能力中等；甘草素的app約為17.0×10?6cm/s，說明甘草素跨膜轉運能力良好。甘草苷和甘草素在MDCK-MDR1細胞模型中E＜2，提示甘草苷和甘草素主要以被動擴散形式跨膜轉運，均不存在P-糖蛋白外排轉運蛋白介導的跨膜轉運機制。

表5 甘草苷和甘草素在MDCK-MDR1細胞模型的Papp值和RE

4 討論

本研究根據文獻報道的黃酮類化合物吸收和代謝特點[18]，針對性地對大鼠體內甘草苷、總甘草素和游離甘草素暴露量進行預實驗研究，研究結果表明甘草苷在血漿中的主要存在形式為甘草素的II相結合產物，因此本實驗采取β-葡萄糖醛酸酶水解總苷的方式定量分析總甘草素和游離甘草在體內吸收分布中的暴露特征從而間接表征甘草苷在體內的動態變化。另外，采用MDCK-MDR1細胞模型研究甘草苷和甘草素各自的跨膜轉運能力和轉運方式，為進一步闡明藥物吸收機制提供了依據。

本實驗中甘草苷在大鼠體內的吸收不呈線性動力學特征，這需要進一步闡明其飽和機制，再根據非線性動力學的規律，指導臨床試驗的用藥方案和劑量調整。藥物不呈現線性動力學特征的主要原因是體內的某些系統達到飽和，如酶和轉運體、血漿蛋白結合的飽和、腎小管重吸收的飽和等[19]。在當前甘草苷臨床前藥動學研究中，大鼠的藥動學參數AUC0-t、max隨劑量增加而增加，但增加的比例均小于劑量比，說明體內可能存在某種飽和機制，但機制的闡明還需進一步的試驗，這種非比例化劑量反應關系給預測人體安全有效的劑量范圍帶來復雜性[19]。此外，本實驗發現血漿中總甘草素的藥-時曲線存在雙峰現象，進一步研究了甘草苷（60 mg/kg）單次ig給藥后膽汁排泄情況，結果發現膽汁中總甘草素0～48 h累積排泄分數為（32.1±10.7）%，提示ig給藥后總甘草素存在肝腸循環現象，可能是藥時曲線出現雙峰的原因。

在組織分布中，相對于其他組織，心臟中的游離甘草素濃度在6 h和17 h差別不大，而其他組織17 h時的游離甘草素的濃度比6 h顯著降低，推測心臟組織中的甘草素消除較慢，從現有數據分析這一結果可能會導致兩方面作用，一是延長藥效作用，二是可能會引起心臟組織的蓄積。前期預實驗采集給藥后24 h組織樣本并進行測定，結果表明大部分組織已檢測不到甘草素，其中有一半的大鼠心臟組織中檢測不到甘草素，排除個體差異的因素，這一結果表明甘草素在體內24 h即可大部分消除，不會引起心臟組織的蓄積。因此，心臟組織比較其他組織消除較慢這一現象可能會使藥物作用延長，這一點應該是支持其心血管系統臨床應用的依據。甘草苷擬作為抗心肌缺血類I類新藥進行開發研究，理論上，心臟是甘草苷（甘草素）發揮其抗心肌缺血作用的靶器官之一，但絕不是唯一發揮藥效作用的關鍵因素，單純地從藥物在心臟組織的分布量來衡量其心血管系統作用是不全面的，其更全面深刻的作用機制還需進行進一步的試驗研究。

藥物吸收、分布、排泄僅是發生空間位置上的遷移，統稱為轉運[20]。藥物的體內動態就是其在體內一系列跨膜轉運的綜合效果。轉運體的初步研究表明甘草苷和甘草素主要以被動擴散形式跨膜轉運，均不存在P-gp外排轉運蛋白介導的跨膜轉運機制。因此，不需關注基于P-gp的藥物-藥物相互作用，而且不呈線性動力學的原因也可基本排除這一因素。大多數藥物對于機體來說是外源性物質，且具有一定的脂溶性，推測甘草苷和甘草素的跨膜轉運機制主要是被動擴散中的溶解擴散[21-22]，是否為通過膜上含水孔道轉運的限制擴散還需更進一步的研究。藥物的跨膜轉運是相當復雜的過程，藥物的跨膜轉運不僅直接參與藥物的吸收、分布、排泄等藥動學行為，同時與分布于靶器官的有效藥物濃度密切相關，因此明確藥物的跨膜轉運能力、機制以及對藥物體內動力學的調控作用[23]，對于新藥研發和評價意義重大。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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exposure characteristic andtransport mechanism of liquiritin

ZHANG Ai-jie1, 2, LI Cai3, LIU Yu-kang3, ZHANG Ying-hua4, GU Wei-ling4, DONG Shi-qi1,2, FAN Hui-rong1, 2, GU Yuan5, SI Duan-yun5

1. Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China 2. Key Laboratory of Radiopharmacokinetics for Innovative Drugs, Chinese Academy of Medical Sciences, and Institute of Radiation Medicine, Tianjin 300192, China 3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 4. Jilin Academy of Chinese Medicine Sciences, Changchun 132012, China 5. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China

The total aglycone liquiritigenin represents the primary exposure of liquiritinin rats. The objective of this study was to investigate the characteristics of exposure and transport mechanism of liquiritinin rats and. The results could provide the evidence of liquiritin for its further development as a new drug.The concentration of total aglycone liquiritigenin at different timing points in rat plasma and tissue distribution samples was determined by LC-MS/MS method after an oral administration of liquiritin in rats. The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin software using Rosenbluth method of non-compartment model. The exposure of total aglycone liquiritigenin and free liquiritigenin in rat tissues was investigated. And the transport mechanism of liquiritin and liquiritigenin was clarified using the MDCK-MDR1 cells.Liquiritin did not undergo linear pharmacokinetic characteristic after a single oral dose in rats. The phase II conjugation metabolites of liquiritigenin were the major exposure in plasma and most rat tissues. However, free liquiritigenin was primarily distributed in the tissue of rat liver, uterus, ovary, stomach and intestine. The exposure of total aglycone liquiritigenin in rat tissues did not show any accumulation trends. And the sequence of exposure was: intestine＞plasma＞liver＞kidney＞lung＞stomach＞uterus＞ovary＞fat＞heart＞spleen＞muscle＞testicle.The transport results indicated that both liquiritin and liquiritigenin were not the substrate of P-gp. And the transcellular transport of liquiritigenin from apical to basolateral membrane was higher than that of liquiritin in MDCK-MDR1 cells.Liquiritin did not show linear pharmacokinetic characteristic after a single oral dose in rats. The characteristics of exposure of liquiritigenin in rat tissues indicated that the extent of distribution and type of liquiritigenin were different among tissues. The exposure of total aglycone liquiritigenin in rat tissues did not show any accumulation trends. The transcellular transport of liquiritin and liquiritigenin was mediated by passive diffusion.

liquiritin, liquiritigenin, exposure characteristic, absorptionkinetics, tissue distribution, transcellular transport mechanism

R283

A

0253 - 2670(2021)07 - 2053 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.022

2020-05-28

國家重點研發計劃項目（2018YFC1708203）；中國醫學科學院中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金資助（2018PT35031）；內蒙古自治區科技重大專項（2019ZD004）；天津市自然科學基金青年基金項目（20JCQNJC00320）

張愛杰，男，助理研究員，研究方向為藥動學。E-mail: zhangaijie1986@163.com

董世奇，男，博士，研究方向為藥動學。E-mail: dongsq1314@126.com

樊慧蓉，女，研究員，碩士導師，研究方向為藥動學。E-mail: fanhr99@163.com

[責任編輯 王文倩]