基于內源性代謝物探索吳茱萸辛熱藥性的生物學表征規律

許淑君，孟 晶，周煒煒，王朋倩，張 淼，吳 茵，楊秀娟，隋 峰

基于內源性代謝物探索吳茱萸辛熱藥性的生物學表征規律

許淑君，孟 晶，周煒煒，王朋倩，張 淼，吳 茵，楊秀娟，隋 峰*

中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700

基于代謝組學技術，通過小鼠血清內源性代謝物的變化尋找吳茱萸發揮生物效應的代謝途徑和有關靶點，研究吳茱萸發揮療效的分子機制。小鼠隨機分為對照組和吳茱萸組，給予吳茱萸進行干預，采用超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術分析2組小鼠血樣，采用主成分分析、偏最小二乘判別分析、正交偏最小二乘判別分析等方法，篩選差異代謝物并進行代謝通路分析；使用Cytoscape及Metscape軟件對差異代謝物進行網絡模塊化分析，篩選可能的作用靶點。數據模式識別顯示吳茱萸組與對照組血清樣本完全分離；共獲得13個差異表達代謝物；通路分析共獲得4條通路；網絡模塊化分析共獲得11個模塊，其中花生四烯酸代謝通路和亞油酸代謝通路是最大的2個模塊；在整個模塊中，煙酰胺、花生四烯酸、棕櫚酸、亞油酸節點度均大于均值，涉及的通路包括煙酸和煙酰胺代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝及飽和脂肪酸β-氧化；通過篩選獲得細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶系相關的26個基因。吳茱萸可能通過作用于CYP450酶系，影響花生四烯酸、亞油酸、煙酸和煙酰胺等代謝途徑，調控機體能量代謝，進而實現生物效應。

吳茱萸；內源性代謝產物；代謝組學；花生四烯酸代謝；細胞色素P450

中藥藥性理論是中醫藥理論體系的重要組成部分，四性五味是藥性理論的核心內容。充分利用現代科技手段揭示中藥性味理論的生物內涵對于實現中醫藥理論的客觀化和標準化、提高中醫藥的臨床診治能力至關重要。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth.、石虎(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang或疏毛吳茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang的干燥近成熟果實[1]，是臨床常用的典型辛熱性中藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效，主要用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣等[2-4]。課題組前期研究發現，調節機體能量代謝可能是辛熱中藥發揮生物效應、表征藥性的關鍵環節和作用途徑[5]。為深入揭示其內在的分子機制，本研究借助代謝組學的相關技術和方法，以內源性代謝產物為主要指標，以吳茱萸為研究示例，通過給藥前后小鼠血清中內源性代謝物的差異分析和比對研究，發現主要相關靶點和通路，解析其生物表征模式和特點，為全面揭示中藥藥性理論內涵提供依據。

1 材料

1.1 藥材

吳茱萸購自北京同仁堂，經中國中醫科學院中藥資源中心袁慶軍研究員鑒定為蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth.的干燥近成熟果實。

1.2 動物

清潔級雄性昆明種小鼠20只，4～5周齡，體質量為18～22 g，購自軍事醫學科學院，合格證號SCXK-（軍）2012-0004。動物飼養于動物房，溫度（26±1）℃，自由飲食飲水，適應性飼養7 d。動物實驗遵循中國中醫科學院中藥研究所有關實驗動物管理和使用的規定，均符合3R原則。

1.3 試劑

色譜級甲酸（批號152469）、色譜級甲酸銨（批號152469）、色譜級甲醇（批號152469）、色譜級乙腈（批號136376）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；超純水購自屈臣氏集團。

1.4 儀器

電子天平（美國Mettler Toledo公司）；BSA223S型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；BCD-320D11D型冰箱（信科龍電器股份有限公司）；JIDI-16R臺式多用途高速冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；DW-HL388型?80 ℃超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）；Q EXACTIVE質譜儀、DIONEX Ultimate3000超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（Millipore公司）；KQ-250超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.5 數據庫及軟件

京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫（https://www.genome.jp/kegg/ligand.html）[6-7]；Metabo Analyst 4.0數據庫（https://www.metaboanalyst.ca/）[8]；Metlin數據庫（http://metlin.scripps.edu/）[9]；Mzcloud數據庫（https://www.mzcloud.org/）；HMDB數據庫（https://www.hmdb.ca）[10]；MetScape插件（http:// apps.cytoscape.org/apps/metscape）[11]；Cytoscape 3.7.0軟件（https://www.cytoscape.org/）[12]；Trace Finder軟件。

2 方法

2.1 吳茱萸水煎液的制備

稱取吳茱萸，加入蒸餾水（用量為濃縮后藥液體積的10倍量體積）浸泡30 min后，武火煮至藥液沸騰，轉用文火煎煮30 min，用8層紗布濾過，重復煎煮1次。合并2次濾液，文火濃縮至藥液質量濃度為0.15 g/mL（以生藥量計）。

2.2 動物分組與給藥

小鼠隨機分為對照組和吳茱萸（2.25 g/kg，相當于臨床等效劑量）組，每組10只。吳茱萸組小鼠ig藥物（15 mL/kg），對照組小鼠ig等體積蒸餾水，1次/d，連續4 d。

2.3 血樣采集與處理

給藥結束后，小鼠眼球取血，脫頸椎處死。血樣于4 ℃靜置2 h，4 ℃、11 985×離心10 min，取上層血清，于?80 ℃保存備用[13]。吸取50 μL血清，加入450 μL沉淀劑甲醇-乙腈（1∶1），渦旋30 s，4 ℃、11 985×離心10 min，吸取上清液，進樣分析。

2.4 UPLC-MS/MS分析

2.4.1 色譜條件 Thermo Syncronis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相A為含0.1%甲酸、2 mmoL/L甲酸銨的水，流動相B為乙腈，梯度洗脫：0～1.00 min，95% A；1.00～25.00 min，95%～5% A；25.00～30.00 min，5% A；30.00～30.01 min，5%～95% A；30.01～35.00 min，95% A；進樣量5 μL；體積流量0.3 mL/min。

2.4.2 質譜條件 選擇ESI離子源正、負離子同時掃描模式；一級全掃描分辨率為70 000，掃描范圍/50～1000；二級數據依賴性掃描分辨率為17 500；鞘氣體積流量為10.5 L/min；輔助氣體積流量為3 L/min；電噴霧電壓為2800 V；Stepped NCE值分別為20、40、60 V；毛細管溫度為320 ℃。

2.5 樣品前處理

考察血清樣品和沉淀劑（1∶3、1∶6、1∶9）的比例關系，結果顯示血清樣品與沉淀劑比例1∶9效果最好，適用于本研究中沉淀小鼠血清樣品的蛋白雜質。

2.6 數據分析

在Mzcloud數據庫中鑒別小鼠血清中內源性代謝物的相對分子質量和分子式，選擇Trace Finder自行建立代謝物數據庫，進行峰對齊、保留時間校正、峰面積提取操作[14]。利用HMDB、KEGG、Metlin等數據庫對化合物信息進行檢索和確認。使用Metabo Analyst 4.0中正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析、高通量代謝通路分析等方法進行分析。通過PLS-DA模型篩選出變異權重系數（VIP）＞1的離子，結合單變量統計分析FC＞0.5且＜0.05的限制條件，找出差異性代謝物。利用Cytoscape 3.7.0軟件中MetScape插件繪制代謝網絡圖，預測靶點。

3 結果

3.1 代謝物鑒定方式

以纈氨酸為例鑒定內源性物質，圖1-A為正、負離子模式圖，圖1-B為正離子模式下纈氨酸的色譜峰，圖1-C為正離子模式下纈氨酸色譜峰所對應的二級質譜。

圖1 總離子流圖 (A)、正離子模式下1.08 min出現的色譜峰(B)及其對應的母核離子碎片(C)

3.2 吳茱萸組與對照組小鼠血清比較分析

3.2.1 吳茱萸組與對照組血清UPLC-MS/MS數據模式識別 對吳茱萸組與對照組血清樣本進行PCA分析，結果如圖2-A、B所示，2組血清樣本表現一定的聚集趨勢，但未能完全分離。采用PLS-DA和OPLS-DA分析方法對吳茱萸組和對照組小鼠血清樣本數據展開模式識別，結果如圖2-C～F所示，在有監督的情況下2組樣本聚集性更強，能夠完全分離。OPLS-DA分析方法能夠更大程度地體現2組樣本的聚集性和分離性，表明吳茱萸使小鼠內源性代謝產物產生了改變。

對2組數據進行聚類分析，如圖3-A所示，從樹狀圖可以看出，吳茱萸組和對照組血清樣本數據被完全聚集成不同的2類，每組數據在其自身樣本內部再進行細分。如圖3-B所示，PLS-DA分析發現2組樣本中多個代謝物表現出顯著差異。

K和綠色代表對照組，C和紅色代表吳茱萸組，下圖同

3.2.2 吳茱萸組與對照組差異代謝物篩選 利用PLS-DA分析獲得血清代謝物的VIP值表，其中同時滿足5種算法計算方式且VIP＞1的差異代謝物共有21個。設計20（樣本）×21（變量）的矩陣，采用檢驗手動積分進一步分析，最終篩選得到13個差異代謝物，結果見表1、2。

3.3 代謝通路分析

對“3.2.2”項中篩選得到的13個差異代謝物展開高通量代謝通路分析，結果見表3和圖4，共獲得5條相關代謝通路，分別為花生四烯酸代謝通路、亞油酸代謝通路、煙酸和煙酰胺代謝通路、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路。

圖3 對照組和吳茱萸組血清樣本聚類分析 (A) 及VIP大于1的部分代謝物 (B)

表1 吳茱萸組血清樣本中13個差異代謝物的相對含量

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01；↑表示上調，↓表示上調

*< 0.05**< 0.01control group; ↑ means up, ↓ means down

表2 吳茱萸組血清樣本中13個差異代謝物信息

3.4 代謝組學網絡構建及分析

吳茱萸組與對照組分析獲得的13個差異代謝物的代謝組學網絡模塊圖如圖5所示，該網絡模塊圖可以劃分成11個相關網絡模塊，其中藍色圓形代表相關靶點、粉色六邊形代表該通路中其他代謝物、紅色六邊形代表代謝通路中本研究獲得的差異代謝物，邊表示3種元素之間的關系。利用軟件中Analyze network插件對網絡模塊圖進行拓撲分析，結果見表4，對代謝網絡模塊圖進行整體分析發現節點度值高于平均節點度的差異代謝物共有4個，分別是花生四烯酸（arachidonic acid）、亞油酸（linoleic acid）、煙酰胺（nicotinamide）和棕櫚酸（palmitic acid）[15]，上述4個差異代謝物分別是所構建的花生四烯酸代謝通路、亞油酸代謝通路、煙酸及煙酰胺代謝通路、飽和脂肪酸β-氧化通路的代謝產物，并且這4個通路在代謝組學網絡模塊圖中占比最大。

表3 13個差異代謝物的相關通路分析

3.5 相關性分析與分層聚類分析

采用相關性分析與分層聚類分析方法對吳茱萸組和對照組小鼠的血清樣本數據進行處理。對2組小鼠血清中的13個差異代謝物進行相關性分析，結果如圖6所示，紅色代表正相關性，包括乙酰左旋肉堿（-acetylcarnitine）、花生四烯酸、棕櫚酸、油酸（oleic acid）、反油酸（elaidic acid）、肌酸（creatine）、二十碳六烯酸（docosahexaenoic acid）、亞油酸、硬脂酸（stearic acid）以及β-羥基丁酸（β-hydroxybutyrate）；綠色代表負相關性，包括-纈氨酸（-valine）、甜菜堿（betaine）、煙酰胺（nicotinamide）。顏色越深，表示相關性越強，反之越弱。

圖5 13個差異代謝物代謝組學網絡模塊圖

表4 13個差異代謝物的代謝網絡拓撲參數

分層聚類分析可得到13個差異代謝物的熱圖如圖7所示，圖中顏色深淺表示這些差異代謝物在2組之間數值變化的大小。從圖中可以看出，吳茱萸組和對照組血清樣本分離程度較好，表明吳茱萸給能夠對機體代謝物產生一定的影響。

圖6 13個差異代謝物相關性分析

圖7 13個差異代謝物分層聚類分析熱圖

3.6 靶點預測及分析

對上述代謝組學網絡中的相關靶點進行預測，共獲得80個相關基因，其中節點度高于平均值的基因共有26個，如表5所示，均為代謝網絡模塊圖中2個最大模塊的共有基因。利用度中心性、接近中心性和中介中心性算法對上述26個基因在代謝網絡中的重要程度進行評估，發現26個基因度中心性值均為18、接近中心性值均為0.508 108 11、中介中心性值均為0.008 825 65，表明其在代謝網絡中的重要性相同。進一步分析發現這26個基因同屬細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）超家族，表明吳茱萸可能通過作用于CYP450來改變小鼠體內代謝物，進而發揮藥效。本課題組前期對熱性中藥附子研究發現[16]，其關鍵作用靶點也屬于CYP450，提示熱性中藥發揮藥效的作用機制可能與CYP450關系密切。

表5 代謝組學網絡中度值大于平均值的基因

4 討論

吳茱萸中含有生物堿、揮發油、苦味素等多種化學成分，其中生物堿是其主要的活性成分[17]。吳茱萸為臨床常用的辛熱性中藥，現代藥理學研究表明，吳茱萸堿具有抗炎鎮痛、強心、降壓、抗腫瘤、保護腦缺血損傷等多種藥理作用[18-20]。炎癥反應是當機體受到致炎因子感染或化學、物理損傷時迅速發生的直接性防御反應，主要表現為紅腫熱痛或功能障礙等[21]。吳茱萸堿能夠通過抑制白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β、環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）等炎癥因子的表達和釋放，從而發揮抗炎作用[22]。

本研究基于代謝組學技術分析吳茱萸干預后小鼠血清中代謝物的變化，采用OPLS-DA、PLS-DA、PCA、聚類分析等方法識別小鼠血清樣本數據變化模式。由PCA分析結果可知，吳茱萸組和對照組血清樣本均有一定的聚集成群的趨勢；PLS-DA和OPLS-DA結果顯示，在有監督的情況下，吳茱萸組和對照組血清樣本聚集趨勢進一步增強，達到完全分離狀態，表明吳茱萸組小鼠血清中代謝物水平發生顯著變化。相關性分析和分層聚類分析結果顯示，與對照組比較，吳茱萸組小鼠血清中代謝產物水平發生顯著變化，且2組之間分離程度較好，驗證了吳茱萸能夠調節小鼠血清中代謝產物水平。經篩選共獲得花生四烯酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸等13個差異代謝物，可作為吳茱萸干預后的生物標志物，除-纈氨酸、甜菜堿、煙酰胺水平呈上升趨勢外，其余8個差異代謝物水平均為下降趨勢?；ㄉ南┧?、亞油酸、肌酸、棕櫚酸等與機體蛋白質代謝、脂質代謝等能量過程密切相關[23-25]，表明吳茱萸可能通過促進機體對花生四烯酸、亞油酸、肌酸等代謝產物的吸收和利用，影響機體能量代謝狀態，發揮其辛熱中藥的藥效作用，與課題組前期對熱性中藥生物效應研究的結果一致[26]。

本研究發現，亞油酸、花生四烯酸、煙酸及煙酰胺代謝通路是吳茱萸作用于機體的主要代謝通路。亞油酸能夠刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等多種炎癥因子的表達，加速炎癥反應[27]；花生四烯酸作為一種具有重要生物功能的多不飽和脂肪酸，能夠促進促炎介質的合成，放大炎癥反應[28]；煙酰胺能夠通過調節機體能量代謝，阻斷炎癥細胞活化，抑制IL-8、IL-6、IL-1β等炎癥因子的釋放[29-30]。吳茱萸能夠上調煙酸和煙酰胺代謝通路，抑制花生四烯酸和亞油酸代謝通路，提示這可能是吳茱萸作為辛熱性中藥發揮抗炎、調節免疫的作用機制之一。

代謝通路靶點分析結果表明，CYP450可能是吳茱萸在機體內發揮作用的關鍵靶點。CYP450作為機體內重要的代謝酶，能催化多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）生成不同的代謝產物[31-32]?；ㄉ南┧崤cCYP450關系密切，其在機體內的第三條代謝途徑就是通過CYP2C、CYP2J2等的環氧化作用生成環氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）[33-34]。EETs不僅能夠維持心臟功能，還能夠抑制單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子的釋放，發揮抗炎作用[33]。因此，本研究中篩選獲得的CYP2C、CYP2J2可能是吳茱萸發揮抗炎作用的靶點，但其確切的分子機制有待進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Exploring biological characterization of “hot” pungentbased on endogenous metabolites

XU Shu-jun, MENG Jing, ZHOU Wei-wei, WANG Peng-qian, ZHANG Miao, WU Yin, YANG Xiu-juan, SUI Feng

Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To explore the pathways and targets evoked by Wuzhuyu () as well as the molecular mechanism related to its biological effect through the changes of endogenous metabolites.Mice were randomly divided into control group andgroup,was given to intervene. The blood samples of two groups were analyzed by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The analysis methods such as principal component analysis, partial least squares discrimination analysis and orthogonal partial least squares discrimination analysis were selected to identify data patterns. Differential metabolites were screened according to VIP > 1 and manual integral calculation, and then the metabolic pathways analysis was performed. Cytoscape and Metascape software were used to establish the network modularization analysis of differential metabolites and screen possible targets.The result of data pattern recognition showed that serum sample ofgroup was completely separated from control group and 13 differential expressed metabolites were obtained. Fout pathways were found by pathway analysis. Network modular analysis obtained 11 modules in total, among which arachidonic acid and linoleic acid metabolic pathway were the two largest modules. In the whole module, the node degrees of nicotinamide, arachidonic acid, palmitic acid and linoleic acid were all greater than the mean. The pathways involved nicotinic acid and nicotinamide metabolism, arachidonic acid metabolism, linoleic acid metabolism and saturated fatty acid β-oxidation. A total of 26 genes were screened out, all of which were belong to cytochrome P450 enzyme system.may regulate energy metabolism and affect metabolic pathways of arachidonic acid, linoleic acid, nicotinic acid and nicotinamide by acting on cytochrome P450 enzymes to achieve biological effect.

(Juss.) Benth.; endogenous metabolites; metabolomics; arachidonic acid metabolism; cytochrome P450

R285.5

A

0253 - 2670(2021)07- 1994 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.017

2020-12-09

國家自然科學基金面上項目（81873024）；國家自然科學基金青年項目（81903819）；北京市自然科學基金資助項目（7202143）；中國中醫科學院傳承項目（KT18002ZX）

許淑君（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥學。Tel: 18811022024 E-mail: 1419189744@qq.com

隋 峰，博士生導師，研究員，研究方向為中藥藥性和藥理。E-mail: suifeng2136@126.com

[責任編輯 李亞楠]