重樓皂苷Ⅶ對胰腺癌PANC-1細胞增殖、遷移與侵襲作用及機制研究

何 昊，劉 楊，錢小英，靳曼菲，鄭 蕾*，成 昭

重樓皂苷Ⅶ對胰腺癌PANC-1細胞增殖、遷移與侵襲作用及機制研究

何 昊1，劉 楊2，錢小英1，靳曼菲1，鄭 蕾1*，成 昭1

1. 西安醫學院藥學院，陜西 西安 710021 2. 空軍軍醫大學 藥學系，陜西 西安 710032

研究重樓皂苷Ⅶ對人胰腺癌PANC-1細胞增殖、遷移與侵襲作用及機制。采用MTT法檢測重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞存活率的影響；觀察重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞形態的影響；采用劃痕實驗和Transwell小室法考察重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞遷移和侵襲能力的影響；采用流式細胞術檢測重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞凋亡的影響；采用Western blotting法檢測重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、DNA酶抑制物（inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease，ICAD）和程序性死亡分子配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）蛋白表達的影響。重樓皂苷Ⅶ可抑制PANC-1細胞存活率，顯著抑制PANC-1細胞遷移和侵襲能力（＜0.01），顯著誘導PANC-1細胞凋亡（＜0.05、0.01），顯著升高PANC-1細胞中凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3、PARP、Bax表達水平（＜0.01），顯著降低pro-PARP、ICAD、Bcl-2、PD-L1蛋白表達水平（＜0.05、0.01）。重樓皂苷Ⅶ能夠抑制PANC-1細胞增殖、遷移和侵襲，并可能通過下調PD-L1表達誘導PANC-1細胞凋亡。

重樓皂苷Ⅶ；胰腺癌PANC-1細胞；增殖；凋亡；程序性死亡分子配體-1

胰腺癌發病率位居腫瘤第10位，死亡率位居第4位，患者的5年生存率僅有9%[1]。2017年我國新增約8.36萬胰腺癌新發病例和8.51萬死亡病例[2]。胰腺癌惡性程度高、侵襲轉移能力強，且由于胰腺的解剖位置較深，早期臨床癥狀隱匿不易診斷，超過85%患者初次診斷時癌細胞已經出現局部浸潤或轉移，預后效果不佳[3]。手術結合化療是目前胰腺癌臨床治療的主要手段，但由于胰腺癌細胞的特性，傳統化療藥物極易出現耐藥性，因此，抗胰腺癌的新藥開發迫在眉睫。中藥及其活性成分具有良好的抗腫瘤作用。重樓為百合科植物云南重樓Smith var．(Franch.) Hand- Mazz.或七葉一枝花Smith var.(Franch.) Hara的干燥根莖，主要分布于云南、四川、陜西等地，性微寒、味苦[4]。七葉一枝花為秦巴山區特色太白七藥之一，為清熱解毒類中藥，用于治療癰瘡、咽喉腫痛、毒蛇咬傷等。現代藥理學研究表明，甾體皂苷為重樓中發揮主要藥效作用的成分，其苷元主要為薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元2類，重樓皂苷Ⅶ為具有偏諾皂苷元的皂苷類化合物，具有良好的抗腫瘤活性[5-6]。本研究考察了重樓皂苷Ⅶ對人胰腺癌PANC-1細胞增殖、遷移及侵襲的影響，為重樓皂苷用于抗腫瘤治療提供基礎。

1 材料

1.1 細胞

PANC-1細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 藥品與試劑

重樓皂苷Ⅶ（質量分數≥98%，批號76296?75?8）購自成都普菲德生物技術有限公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、青鏈霉素混合液購自美國HyClone公司；四甲基偶氮唑藍噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；Hoechst 33258染料購自美國MedChemExpress公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（批號20180406）購自上海七海復泰生物科技有限公司；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自陜西先鋒生物科技有限公司；程序性死亡分子配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）蛋白抗體（批號00071664）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（批號00027610）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗體（批號00022011）、DNA酶抑制物（inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease，ICAD）抗體（批號00021351）、B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號00045121）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-associated X protein，Bax）抗體（批號00039510）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號10004129）購自美國Proteintech公司；羊抗鼠二抗（批號115?035?003）購自美國Jackson ImmunoResearch Laboratories。

1.3 儀器

3111型CO2培養箱、Multiskan GO自動全波長酶標儀、MicroPure超純水機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；CJ-2S104超凈工作臺（天津泰斯特儀器有限公司）；AX224ZH分析電子天平（美國OHAUS公司）；Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）；ChemiDoc XRS＋化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

PANC-1細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2.2 重樓皂苷Ⅶ母液的配制

重樓皂苷Ⅶ溶于DMSO配制成100 mmol/L母液，分裝保存于?20 ℃冰箱。臨用時用DMEM高糖培養基稀釋至不同濃度。

2.3 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞存活率的影響

取處于對數生長期的PANC-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培養基重懸，以1×105/mL接種于96孔板中，100 μL/孔，于培養箱中培養24 h。設置對照組及重樓皂苷Ⅶ（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 μmol/L）組，棄去培養基，給藥組分別加入100 μL不同濃度的重樓皂苷Ⅶ溶液，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h后，棄去培養基，PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入100 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），于37 ℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（），計算細胞存活率。

2.4 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞形態的影響

取處于對數生長期的PANC-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培養基重懸，以1.5×105/mL接種于6孔板中，2 mL/孔，于培養箱中培養24 h。設置對照組及重樓皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）組，棄去培養基，給藥組分別加入2 mL不同濃度的重樓皂苷Ⅶ溶液，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h后，棄去培養基，PBS緩沖液洗滌2次，加入2 mL 70%冰乙醇固定30 min，PBS緩沖液洗滌，加入2 mL Hoechst 33258染液（5 μg/mL），避光染色15 min，PBS緩沖液洗滌，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞遷移和侵襲的影響

2.5.1 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞水平遷移能力的影響 取處于對數生長期的PANC-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培養基重懸，以1.5×105/mL接種于6孔板中，2 mL/孔，待細胞貼壁后，棄去培養基。設置對照組及重樓皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）組，給藥組分別加入2 mL不同濃度的重樓皂苷Ⅶ溶液，對照組加入不含藥物的培養基，于培養箱中培養，分別于0、12、24、48 h在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.5.2 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞垂直遷移能力的影響 Transwell小室置于24孔板中，取處于對數生長期的PANC-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培養基重懸，以2×105/mL接種于Transwell小室中。設置對照組及重樓皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）組，給藥組Transwell小室下室分別加入600 μL不同濃度的重樓皂苷Ⅶ溶液（重樓皂苷Ⅶ母液以20%胎牛血清的DMEM高糖培養基稀釋），對照組加入不含藥物的培養基，于培養箱中培養24 h。棄去Transwell小室中培養基，PBS緩沖液洗滌，甲醇固定20 min，0.1%結晶紫溶液染色3 min，PBS緩沖液洗滌，用棉簽擦去小室內細胞，于顯微鏡下觀察細胞。

2.5.3 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞侵襲能力的影響 Transwell小室置于24孔板中，按照1∶3將Matrigel膠用預冷的無血清培養基稀釋，40 μL/孔，均勻鋪于Transwell小室底部，于培養箱中孵育5 h，棄去小室內殘余液體。取處于對數生長期的PANC-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培養基重懸，以4×105/mL接種于Transwell小室中。后續操作同“2.5.2”項步驟。

2.6 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞凋亡的影響

取處于對數生長期的PANC-1細胞，以1.5×105/mL接種于6孔板中，2 mL/孔，于培養箱中培養24 h。設置對照組及重樓皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0 μmol/L）組，棄去培養基，給藥組分別加入2 mL不同濃度的重樓皂苷Ⅶ溶液，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h后，棄去培養基，收集細胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書染色，采用流式細胞儀進樣分析。

2.7 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1蛋白表達的影響

取處于對數生長期的PANC-1細胞，以1.5×105/mL接種于T25培養瓶中，培養24 h，棄去培養基。設置對照組、重樓皂苷Ⅶ（1 μmol/L）組，給藥組加入2 mL重樓皂苷Ⅶ溶液，對照組加入不含藥物的培養基，分別培養0、12、24、48 h，收集細胞，按照RIPA裂解液說明書提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，加入上樣緩沖液于100 ℃加熱變性。蛋白樣品經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，洗滌后分別加入Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1抗體，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入羊抗鼠二抗，于室溫孵育2 h，洗滌后加入ECL發光液，采用化學發光成像系統曝光。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞存活率的影響

如圖1所示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組細胞存活率降低，呈劑量相關性，重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞的半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）值為（1.27±0.18）μmol/L，因此選擇0.5、1.0、2.0 μmol/L重樓皂苷Ⅶ進行后續研究。

圖1 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞存活率的影響()

3.2 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞形態的影響

如圖2所示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組細胞形態發生變化，出現顆粒狀凋亡小體，鏡下可見核濃縮和核碎裂。

3.3 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞遷移和侵襲的影響

如圖3所示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組PANC-1細胞遷移率顯著降低（＜0.01），且呈劑量和時間相關性；如圖4所示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組從小室上層透過聚碳酸酯膜進入下室的細胞數顯著減少（＜0.01），呈劑量相關性，表明重樓皂苷Ⅶ可抑制PANC-1細胞的遷移和侵襲能力。

3.4 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞凋亡的影響

如圖5、表1所示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ（0.5 μmol/L）組中末期凋亡細胞比例顯著升高（＜0.01），重樓皂苷Ⅶ（1.0、2.0 μmol/L）組早期凋亡細胞和中末期凋亡細胞比例均顯著升高（＜0.05、0.01）表明重樓皂苷Ⅶ可誘導PANC-1細胞凋亡。

3.5 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ組Cleaved Caspase-3、PARP、Bax蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），pro-PARP、ICAD、Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），且呈時間相關性，表明重樓皂苷Ⅶ可促進PANC-1細胞凋亡。如圖7所示，重樓皂苷Ⅶ組PD-L1蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），呈時間相關性，表明重樓皂苷Ⅶ誘導PANC-1細胞死亡可能與下調PD-L1表達相關。

圖2 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞形態的影響 (×200)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖4 重樓皂苷VII對PANC-1細胞垂直遷移 (A、C) 及侵襲(B、D) 的影響()

圖5 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞凋亡的影響

表1 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞凋亡的影響()

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group

圖6 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞中凋亡相關蛋白表達的影響()

圖7 重樓皂苷Ⅶ對PANC-1細胞中PD-L1蛋白表達的影響()

4 討論

胰腺癌侵襲性強，早期易轉移，患者生存率較低。天然產物是抗腫瘤藥物研發的重點來源[6]，從中藥中尋找具有抗胰腺癌作用的活性成分具有重要意義。重樓皂苷Ⅶ為中藥重樓中的主要活性成分，課題組前期研究發現重樓皂苷Ⅶ具有較好的抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲，并可通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路誘導腫瘤細胞凋亡[7]。本研究結果顯示，重樓皂苷Ⅶ可抑制PANC-1細胞增殖、遷移和侵襲，誘導PANC-1細胞凋亡。

PD-1/PD-L1是一對免疫共刺激因子，PD-1表達于T細胞表面和初級B細胞表面，PD-L1作為其配體，在腫瘤細胞及浸潤的淋巴細胞均有表達。正常情況下，PD-1通過PD-L1發揮免疫調控作用，PD-1/PD-L1通路的激活可減少免疫反應對正常組織的損傷，避免自身免疫疾病[8-9]。PD-1/PD-L1還可參與腫瘤免疫逃逸，其激活可降低腫瘤局部微環境T細胞的免疫效應，使腫瘤細胞逃避機體免疫監視和殺傷，促進腫瘤發生；阻斷PD-1/PD-L1通路可逆轉腫瘤免疫微環境，增強內源性抗腫瘤免疫效應[10]。腫瘤細胞能夠通過上調PD-L1表達來逃避T細胞識別，從而逃避免疫殺傷[8,11]。本研究結果顯示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ可顯著上調PANC-1細胞中凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3、PARP、Bax表達水平，顯著降低pro-PARP、ICAD、Bcl-2、PD-L1蛋白表達水平，表明重樓皂苷Ⅶ可誘導PANC-1細胞凋亡。

綜上所述，重樓皂苷Ⅶ能夠抑制PANC-1細胞增殖、遷移和侵襲，誘導其凋亡，同時可能通過下調PD-L1蛋白表達參與免疫調節。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Siegel R L, Miller K D, Jemal A. Cancer statistics, 2020 [J]., 2020, 70(1): 7-30.

[2] 徐曉慧, 曾新穎, 王黎君, 等. 1990年與2017年中國胰腺癌疾病負擔分析 [J]. 中華流行病學雜志, 2019, 40(9): 1084-1088.

[3] Zheng W, Lu S L, Cai H L,. Deguelin inhibits proliferation and migration of human pancreatic cancer cellstargeting hedgehog pathway [J]., 2016, 12(4): 2761-2765.

[4] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 271-272.

[5] Pang D, Li C, Yang C,. Polyphyllin VII promotes apoptosis and autophagic cell death via ROS-inhibited AKT activity, and sensitizes glioma cells to temozolomide [J]., 2019, 2019: 1805635.

[6] Wang Y, Zhong J, Bai J J,. The application of natural products in cancer therapy by targeting apoptosis pathways [J]., 2018, 19(9): 739-749.

[7] He H, Xu C, Zheng L,. Polyphyllin VII induces apoptotic cell death via inhibition of the PI3K/Akt and NF?κB pathways in A549 human lung cancer cells [J]., 2020, 21(2): 597-606.

[8] Keir M E, Butte M J, Freeman G J,. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity [J]., 2008, 26: 677-704.

[9] Saresella M, Rainone V, Al-Daghri N M,. The PD-1/PD-L1 pathway in human pathology [J]., 2012, 12(3): 259-267.

[10] Pardoll D M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy [J]., 2012, 12(4): 252-264.

[11] Chen L P, Flies D B. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co-inhibition [J]., 2013, 13(4): 227-242.

Effect and mechanism of polyphyllin VII on proliferation, migration and invasion of pancreatic cancer PANC-1 cells

HE Hao1, LIU Yang2, QIAN Xiao-ying1, JIN Man-fei1, ZHENG Lei1, CHENG Zhao1

1. School of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China 2. School of Pharmacy, Air Force Medical University, Xi’an 710032, China

To study the effect and mechanism of polyphyllin Ⅶ on proliferation, migration and invasion of human pancreatic cancer PANC-1 cells.MTT assay was used to detect the effect of polyphyllin Ⅶ on viability of PANC-1 cells. Effect of polyphyllin Ⅶ on morphology of PANC-1 cells was observed. Effect of polyphyllin Ⅶ on cell migration and invasion were detected by wound scratch assay and Transwell chamber. Effect of polyphyllin Ⅶ on apoptosis was detected by flow cytometry. Western blotting was used to detect the effect of polyphyllin Ⅶ on expressions of cysteine protease-3 (Caspase-3), B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-associated X protein (Bax), poly ADP-ribose polymerase (PARP), inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease (ICAD), and programmed death ligand 1 (PD-L1) in PANC-1 cells.Survival rate of PANC-1 cells was inhibited, migration and invasion of PANC-1 cells were significantly inhibited (< 0.01), cell apoptosis was significantly induced (< 0.05, 0.01), expressions of apoptosis-related proteins Cleaved Caspase-3, PARP, Bax were significantly increased (< 0.01), and expressions of pro-PARP, ICAD, Bcl-2, and PD-L1 were significantly reduced by polyphyllin Ⅶ(< 0.05, 0.01).Polyphyllin Ⅶcan inhibit proliferation, migration and invasion of PANC-1 cells, and may induce PANC-1 cell apoptosis by down-regulating PD-L1 expression.

polyphyllin Ⅶ; PANC-1 cells; proliferation; apoptosis; programmed death ligand 1

R285.5

A

0253 - 2670(2021)07 - 1981 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.015

2020-11-10

國家自然科學基金青年項目（81603265）；陜西省創新人才推進計劃-青年科技新星項目（2019KJXX-057）；陜西省高校青年杰出人才支持計劃（05041904）；陜西省科技廳面上項目（2021JM-489）；國家級大學生創新訓練項目（201911840017）

何 昊（1985—），副教授，博士，從事中藥抗腫瘤及免疫研究。Tel: (029)86177545 E-mail: hehao313@163.com

鄭 蕾，副教授，博士。Tel: (029)86177548 E-mail: zhengleixa@163.com

[責任編輯 李亞楠]