原發性干燥綜合征患者淚液及唾液中細胞因子水平變化研究

陳 曄，王文婷，詹 峰

1.常州市腫瘤醫院 檢驗科，江蘇 常州 213003；2.聯勤保障部隊第九〇四醫院常州院區 神經內科，江蘇 常州 213003

原發性干燥綜合征是一種以女性多發的全身性風濕性和自身免疫性疾病，其特征是多個部位的外分泌腺淋巴細胞浸潤，特別是唾液腺和淚腺[1]。臨床上，干燥綜合征可影響多個器官及系統，包括皮膚、呼吸道、泌尿生殖道和胃腸道中的外分泌腺，以及胰腺外器官受累[2]。當淋巴細胞浸潤累及淚腺和唾液腺，可造成淚液和唾液分泌質量改變、減少，最終導致干眼癥和口腔干燥癥。目前，原發性干燥綜合征導致的干眼癥和口腔干燥癥發病機制仍未完全明確。此外，用于測定眼部和口腔體征的臨床工具通常易受主觀影響，且取決于醫師的臨床經驗。而細胞因子分析檢測的優點是不易產生主觀偏倚[3]。原發性干燥綜合征的組織學特征為單核細胞向外分泌腺的浸潤，CD4+T細胞、B細胞亞群、樹突細胞、巨噬細胞通過引發炎癥反應導致功能障礙并最終破壞外分泌腺[4]。盡管已有研究報道原發性干燥綜合征患者的細胞因子表達水平[5]，但未同時比較來自同一個體的淚液及唾液中的細胞因子水平。本研究分析同一隊列原發性干燥綜合征患者淚液及唾液中的細胞因子譜，旨在探討原發性干燥綜合征患者淚液及唾液中的細胞因子水平。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取自2015年6月至2019年6月于常州市腫瘤醫院就診的45例原發性干燥綜合征患者為研究對象，并將其納入B組。納入標準：符合原發性干燥綜合征國際分類標準[6]；女性。選取同期健康體檢者55例納入A組，均為女性，平均年齡(56.7±10.6)歲。B組患者平均年齡(51.0±13.8)歲。兩組研究對象年齡構成比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比行。本研究經醫院倫理委員會批準。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 Schirmer試紙試驗 將Schirmer淚液試紙圓弧端夾于受試者眼瞼外三分之一處結膜囊內，另一端懸掛于眼外，5 min后取下試紙，測量被淚液濕潤的長度并記錄，然后將試紙轉移至磷酸鹽緩沖液中，-80℃貯存。

1.2.2 靜態全唾液流率檢測 收集未刺激的全唾液以確定唾液分泌速率。采集唾液前，讓受試者以清水漱口，去除口腔內食物殘渣，然后向無菌eppendorf管內持續吐唾液，保持5 min。樣本以4℃、5 000 r/min離心20 min，取上清，將其等分，-80℃儲存。

1.2.3 淚液及唾液細胞因子水平分析 將儲存在磷酸鹽緩沖液中帶有Schirmer條帶的eppendorf管在冰上解凍，渦旋，并將105 μl樣品轉移到新管中。將唾液樣品以4℃、5 000 r/min離心5 min，將105 μl上清液轉移至新管中。然后以12 000 r/min、4℃離心10 min。部分上清液用于蛋白質測量，并將等體積的磷酸鹽緩沖液/1.0%牛血清白蛋白加入剩余的樣品中。吸取所得磷酸鹽緩沖液/0.5%牛血清白蛋白懸浮液25 μl加入廣譜篩選試劑盒(Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay，貨號M50-0KCAF0Y)板上，檢測白細胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、IL-8、IL-17A、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、巨噬細胞炎癥蛋白1b(macrophage inflammatory protein 1b，MIP-1b)、干擾素誘導蛋白10(interferon-inducible protein 10，IP-10)和巨噬細胞炎癥蛋白1a(macrophage inflammatory protein 1a，MIP-1a)等細胞因子。使用蛋白定量試劑盒(Pierce BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific)估算Schirmer條帶懸浮液和唾液中的總蛋白質濃度。

2 結果

2.1 兩組研究對象臨床干眼評估及口腔檢查結果比較 A組Schirmer試驗濕潤長度為(21.0±6.7)mm，長于B組的(4.2±1.9)mm，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。A組靜態全唾液流率為(2.8±0.4)ml/min，高于B組的(0.9±0.3)ml/min，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 兩組研究對象淚液及唾液中細胞因子水平比較 B組淚液IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A、IFN-γ、MIP-1b、IP-10水平均顯著高于A組，兩組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。B組唾液IP-10、MIP-1a水平均顯著高于A組，兩組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組研究對象淚液及唾液中細胞因子水平比較(a.淚液中細胞因子水平；b.唾液中細胞因子水平)

2.3 Schirmer試驗濕潤長度、靜態全唾液流率與細胞因子水平相關性分析 Schirmer試驗濕潤長度與淚液中IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A、IFN-γ、MIP-1b水平呈負相關(r=-0.434、-0.528、-0.492、-0.463、-0.663、-0.604，P<0.05)。靜態全唾液流率與唾液中IP-10、MIP-1a水平呈負相關(r=-0.289、-0.289，P<0.05)。

3 討論

在唾液和淚液中發現分子及免疫生物標志物有利于干燥綜合征患者的疾病診斷，并幫助建立靶向治療[7]。干眼癥是多因素造成的眼表面疾病，與眼表炎癥和損傷有關，特征為淚膜體內平衡喪失[8]。本研究中，與A組比較，B組患者淚液中Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ，以及Th2型細胞因子IL-4水平均升高。既往研究表明，干燥綜合征患者常并發干眼癥，在眼結膜組織中可發現大量活化的CD4+T輔助細胞，提示T細胞歸巢進一步促進了結膜中的免疫激活[9]。此外，這些活化的CD4+T輔助細胞在眼結膜組織中分泌促炎細胞因子可能通過Th1和Th2介導的免疫反應造成眼表損傷。IFN-γ可由天然殺傷細胞、單核細胞、巨噬細胞分泌。有研究報道，IFN-γ水平升高與干燥綜合征相關，可與上皮組織相互作用產生炎癥反應[10-12]，還可以通過激活外源性凋亡在角膜上皮細胞凋亡和組織破壞中發揮重要作用[13]。IL-12主要由巨噬細胞和樹突細胞產生，在調節IFN-γ產生和促進Th1應答中起重要作用。

本研究中，上調的IL-4主要參與Th2介導的免疫應答和B細胞的活化，這些細胞因子在固有和適應性免疫中起關鍵作用，并提示患者疾病進展。 本研究中，B組患者淚液中MIP-1b和IL-8水平顯著升高。MIP-1b和IL-8可以吸引Th1細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞表達特定受體(如CCR5和CXCR3)的樹突細胞到角膜和結膜組織[14]。有研究表明，干眼癥患者淚液中MIP-1b水平顯著增加[15]。此外，IL-8對T細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞具有趨化作用。因此，T淋巴細胞的這種大量浸潤和活化可能通過細胞毒性和細胞凋亡導致淚腺和眼表組織損傷。

本研究中，B組患者唾液IP-10、MIP-1a水平升高，且與靜態全唾液流率相關。原發性干燥綜合征對牙周疾病有負面影響[16]，IP-10參與了干燥綜合征患者唾液腺中T細胞浸潤的累積[17]，牙周病患者唾液中MIP-1a水平更高[18]。本研究中，B組患者淚液中抗炎細胞因子IL-17水平增加。有研究在干燥綜合征患者的唾液腺和血清中檢測到IL-17，證實其與干燥綜合征的發病機制相關[19]。此外，IL-17還可能在干眼病的角膜上皮屏障破壞中發揮作用。

綜上所述，原發性干燥綜合征患者淚液及唾液中細胞因子水平顯著升高，且與淚液生成減少、唾液流率減緩顯著相關，從而參與影響眼干、口干的臨床癥狀。