細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3在宮頸癌中表達及臨床意義

鄭 樂

中國醫科大學腫瘤醫院(遼寧省腫瘤醫院) 婦科，遼寧 沈陽 110042

宮頸癌位于女性多發惡性腫瘤第二位[1]，且預后差，主要與其發生侵襲轉移相關。尋找宮頸癌早期診斷、預測病情嚴重程度的標志物及宮頸癌的治療靶點至關重要。周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)的負調節蛋白激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs)，通過與CDKs或CDK-cyclin復合物相互結合，從而抑制CDKs活性，調節細胞周期正常有序地進行[2-3]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)屬于CKIs中的一類，是細胞周期調控網絡中的重要一環[4]。CNKN3在正常的細胞周期中主要作為CDK2的抑制因子，在G1～S期與CDK2穩定結合，從而參與調節細胞周期[5]。CDKN3在多種惡性腫瘤中表達異常，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、食管癌等，其表達水平常與腫瘤的發生發展相關[6-10]。本研究旨在探討CDKN3在宮頸癌中的表達及臨床意義。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集自2015年1月至2016年1月于中國醫科大學腫瘤醫院婦科行手術治療且經病理檢查確診患者的60例宮頸癌組織、30例宮頸原位癌組織、30例正常宮頸組織。60例宮頸癌組織中，患者中位年齡48歲；臨床分期Ⅰ～Ⅱa期32例，Ⅱb～Ⅳ期28例。20例宮頸癌和配對癌旁宮頸組織標本取自于手術切除30 min內組織標本。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人CDKN3多克隆抗體(北京博奧森)；SP試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋)；SDS—PAGE凝膠配制試劑盒(南京凱基生物)。

1.3 研究方法 (1)免疫組織化學法。按試劑盒說明進行(工作濃度為1∶200)。以PBS代替一抗作為陰性對照，以CDKN3陽性染色切片作為陽性對照。(2)蛋白免疫印跡法。對20例早期宮頸癌及配對癌旁組織進行檢測。提取組織中核蛋白，測定蛋白質含量，電泳，轉膜，封閉，加入一抗，緩沖液稀釋(1∶1 000)，孵育聚偏氟乙烯膜，4℃過夜，緩沖液洗3次，每次10 min，將二抗用緩沖液稀釋(1∶2 000)，室溫振蕩孵育1 h，緩沖液洗3次，每次10 min，用ECL發光法試劑盒顯色，凝膠成像系統分析條帶灰度值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析。計數資料以例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學法檢測結果 免疫組織化學法結果顯示，CDKN3陽性表達主要定位于細胞核內，在宮頸癌組織、宮頸原位癌組織、正常宮頸組織中的陽性表達率分別為81.67%(49/60)、60.00%(18/30)、20.00%(6/30)。宮頸癌組織中CDKN3的陽性表達率明顯高于宮頸原位癌組織及正常宮頸組織；宮頸原位癌組織CDKN3的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組織化學法檢測結果(a.CDKN3在宮頸癌組織中的表達；b.CDKN3在宮頸原位癌組織中的表達；c.CDKN3在正常宮頸組織中的表達；SP×400)

2.2蛋白免疫印跡法檢測結果 蛋白免疫印跡法結果顯示，CDKN3蛋白在宮頸癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測結果

2.3 CDKN3在宮頸癌中的表達與宮頸癌臨床病理因素之間的關系 CDKN3在宮頸癌中的表達與臨床分期相關(P<0.05)，與年齡、病理類型無關(P>0.05)。見表1。

表1 CDKN3在宮頸癌中的表達與宮頸癌臨床病理因素之間的關系/例(百分率/%)

3 討論

細胞周期調控異常在腫瘤細胞增殖中起重要作用，與腫瘤進展密切相關。CDKN3選擇性與CDK2結合，降低CDK2使抑癌基因視網膜細胞瘤蛋白(Rb蛋白)磷酸化的能力[11]，去磷酸化的Rb蛋白與轉錄因子E2F1結合，抑制產生細胞周期相由G1/S的轉變所需的蛋白，從而抑制G1相至S相的轉變[12-14]，可以表現抑癌基因的作用。同時，CDKN3也是一種Mdm2結合蛋白，可以與Mdm2和p53形成復合體，降低p21的敏感度，減少p53靶基因產物的生成，從而促進腫瘤細胞周期的進展[15]。

本研究結果顯示，宮頸癌組織中CDKN3呈高表達，正常宮頸組織中CDKN3呈低表達；正常宮頸組織及宮頸原位癌組織中CDKN3的表達水平比較，差異有統計學意義，可能由于此基因是在宮頸腫瘤組織中早期出現的上調基因；CDKN3與宮頸癌的臨床分期相關，提示CDKN3可能在宮頸癌的發生發展過程中起到了重要作用。Lai等[9]對58例腎細胞癌手術切除組織進行免疫組織化學法分析發現，CDKN3蛋白高表達并存在胞漿表達，臨床病理分析表明，其與較高的組織學分級有關。Xing等[16]在肝癌細胞系和臨床樣本中檢測到CDKN3高表達，進一步分析肝癌病例的臨床病理資料發現，CDKN3高表達與腫瘤分期晚和分化程度差相關。Niculescu等[17]在缺乏膽堿的神經母細胞瘤細胞系IMR-32中檢測到CDKN3表達增加，CDKN3高表達的分子機制可能與CDKN3基因啟動子區域的低甲基化有關。Yu等[18]通過對11例卵巢漿液性腺癌和9例卵巢子宮內膜樣腺癌組織進行基因甲基化篩查發現，CDKN3基因甲基化與對照組的正常輸卵管和子宮內膜組織比較明顯降低。

綜上所述，CDKN3與宮頸癌的發生發展密切相關，考慮可將其作為診斷宮頸癌及判斷預后的有效生物指標，但其具體作用機制尚待進一步研究。