富硒大豆低聚肽的制備及其抗疲勞功能的研究

白海軍

(黑龍江八一農墾大學，大慶 163319)

硒元素是一種具有較強抗氧化能力且人體所必需的微量營養元素，它能夠有效預防癌癥、防治多種心腦血管慢性疾病[1]。由于硒元素在地殼中分布不均，部分國家或地區的人們會出現硒缺乏癥，需要通過膳食或藥物干預防治硒缺乏癥。除這部分人群外，研究表明競技型運動員會由于長期訓練導致血硒含量降低，因而體力型勞動從業者也需要服用硒補充劑，防止由缺硒所導致的疲勞氧化損傷從而緩解運動性疲勞[2]。硒補充劑分兩大類：無機硒補充劑主要為硒酸鹽，它毒性較大、生物利用率低，而富含有機硒的富硒農產品相較之下是一種安全、可靠適用人群更廣的硒營養補充品[3]。富硒農產品的生產主要在富硒土壤地區栽培作物，或是在栽培作物的過程中進行葉面施灑無機硒肥料。大豆是一種可聚硒的優質蛋白質植物資源，它能根據環境中無機硒的含量通過轉運途徑轉化為有機硒，并以硒結合蛋白的形式存在于大豆蛋白中[4]。高思薇等[5]研究發現，富硒大豆蛋白酶解后硒蛋白含量更高，在飼喂等量硒元素條件下富硒低聚肽能使血硒更快達到峰值。此外，大豆低聚肽易吸收且具有抗氧化、抗疲勞活性等，但它在原蛋白質序列中并不能顯現出活性[6]。因而，通過酶解處理富硒大豆蛋白制備富硒大豆低聚肽，不但能夠促進硒元素在小腸中的吸收，同時還能進一步提高抗氧化、抗疲勞活性。

根據疲勞產生的“自由基理論”，機體疲勞的產生主要是由于體內活性氧自由基的生成和清除速率失衡，致使活性氧蓄積機體處于氧化應激狀態，從而造成脂質過氧化損傷等一系列副反應，抗過氧化損傷是疲勞緩解與恢復的重要因素。研究表明硒是機體抗氧化物酶的重要組成，體現在硒蛋白參與構成的酶中，作為谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心，主要以硒代半胱氨酸形式存在[7]。郭建軍[8]研究發現，長期訓練的小鼠在高強度運動下硒元素能顯著提高谷胱甘肽過氧化物酶的活性，從而使機體抗脂質過氧化能力增強。劉丹等[9]發現富硒麥芽能夠延長小鼠的游泳時間。

目前，國內外對于富硒大豆低聚肽的抗氧化活性研究較為充分，但其抗疲勞活性的相關研究并不完善，本實驗擬采用富硒大豆為原料制備富硒大豆蛋白低聚肽，并通過電感耦合等離子體質譜法對低聚肽中硒的含量、形態進行測定，在此基礎上建立運動性疲勞小鼠模型，通過負重力竭游泳實驗以及肝糖原、肌糖原、血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛生化指標，對富硒大豆低聚肽的抗運動性疲勞功能進行研究，以期以富硒大豆低聚肽為原材料的抗疲勞類保健品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明種雄性健康小鼠60只，個體質量約(20±2.0)g，購自東北農業大學動醫學院實驗動物中心，飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及自由飲水，恒定濕度55%，室溫(25±1) ℃，自由進食一周后應用于實驗研究。

1.2 材料與試劑

東升1號富硒大豆、中性蛋白酶(Neutrase)、風味蛋白酶(Flavourzyme)、PLBC07610millipore超濾膜-3 ku、生化指標檢測試劑盒；其他所用試劑為分析純。

1.3 儀器與設備

BHS-2恒溫水浴鍋，7500c型電感耦合等離子體質譜，LC-1200型液相色譜，FC酶標儀，磁力攪拌器，德國IKA公司，UV-2600紫外可見分光光度計，恒溫游泳池。

1.4 富硒大豆低聚肽的制備

1.4.1 富硒大豆蛋白的制備

富硒大豆蛋白的制備參考文獻[10]稍作修改，清理新鮮大豆后粉碎過80目篩網，用正己烷脫脂后將富硒大豆粉與去離子水溶解后，調節溶液pH值至4.5沉淀蛋白質，4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min去除上清液后調節溶液pH值至7.0使蛋白質沉淀溶解，冷凍干燥后于密封袋中-20 ℃保存。

1.4.2 富硒大豆低聚肽的制備

富硒大豆低聚肽的制備參考董硯博[11]的方法稍加修改，采用雙酶酶解法提高大豆低聚肽的產率，具體操作如下，配置5%的富硒大豆蛋白溶液，向溶液中加入中性蛋白酶(400 U/g)和風味蛋白酶(200U/g)，在50 ℃下酶解3 h，滅酶后在4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min取上清液，超濾后冷凍干燥后于密封袋中-20 ℃保存。蛋白質含量的測定參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白的測定》，采用微量凱氏定氮法進行計算。

1.5 硒含量的測定

總硒元素測定參考GB5009.268—2016。低聚肽中硒形態的測定采用電感耦合等離子體質譜法參考文獻[12]，將0.5 g的大豆低聚肽、2.0 mL的H2O2、10.0 mL的HNO3于消化管中充分混合，于微波消解儀中消化后定容至容量瓶中。進樣體積10 μL，等度洗脫，流動相A為95%水，流動相B為5%甲醇，流速0.8 mL/min，洗脫時間20 min。

1.6 動物實驗

1.6.1 動物模型的建立

將60只健康雄性小鼠隨機分為6組，設立對照組、模型組、富硒大豆低聚肽低/高劑量組(SeP-L/H)、大豆低聚肽低/高劑量組(P-L/H)。采用灌胃法給予樣品容量均0.2 mL/d，模型組、對照組給予等量生理鹽水，大豆低聚肽劑量組分別設置為20、100 mg/(kgbw·d)兩個劑量組。動物模型的建立如下：在實驗第1周進行適應性游泳訓練，除除模型組外，其余6組小鼠在第1周每日游泳訓練10 min，第2周訓練15 min，第3周負重自身體重5%訓練至力竭，實驗7 d為1周期，每隔6 d休息1 d，每周稱重，約21 d后小鼠出現動作遲緩、鼠毛稀疏、食欲減退等典型運動性疲勞行為學異常狀況。

1.6.2 負重力竭游泳實驗

末次給予樣品30 min后，將小鼠置于(25±1)℃的恒溫游泳箱中，鼠尾根部負荷約體重5%的鉛皮，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間(min)。當小鼠完全下沉至水面下超過10 s且撈出后無法完成翻正反射，即為力竭。

1.7 生化指標檢測方法

在力竭游泳實驗結束后立即將小鼠斷頸處死，眼球取血并將采集到的新鮮血液于4℃靜置1 h后，在3 000 r/min條件下分離15 min取上層血清，肝組、肱四頭肌經生理鹽水處理后搗碎處理成10%組織勻漿。肝糖原(LG)、肌糖原(LA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)含量嚴格按照試劑盒操作說明測定，剩余樣本保存于-70 ℃超低溫冰箱中備用。

1.8 統計

應用SPSS 19.0軟件對數據進行。實驗數據以均值±標準偏差(Mean±SD)表示，多樣本均數間比較采用One-way ANOVA檢驗，各組間多重比較采用LSD法，P≤0.05為差異有顯著性。采用Origin 2017軟件進行圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 硒元素分析

經微量凱氏定氮法計算，粉碎富硒大豆粉的蛋白質質量分數約為46.73%，富硒大豆蛋白的蛋白質質量分數為88.32%。實驗通過HPLC-ICP-MS法對大豆分離蛋白以及低聚肽中元素硒含量進行了測定，其中富硒大豆分離蛋白中硒元素含量為(76.39±1.09) μg/kg，大豆低聚肽的中元素硒含量為(90.03±3.23) μg/kg，主要形態硒為硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。富硒大豆低聚肽總硒元素含量高于富硒大豆分離蛋白，可能是由于分子質量為3 ku的富硒大豆低聚肽中所包含硒蛋白序列更多。 Khanam[13]研究發現硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸是谷物和豆類中硒的主要存在形式，與本實驗結果相符。

圖1 ICP-MS色譜圖

2.2 負重力竭游泳實驗

小鼠負重游泳力竭時間的長短是評價受試樣品抗疲勞能力的最直接指標[14]。各組小鼠收拾前后體重的變化及小鼠負重游泳力竭時間見表1，可以發現各組小鼠的體重在試驗前后并未出現顯著差異(P>0.05)，但在第三周模型組有個別小鼠死亡，但總樣本數大于8只，具有統計學意義。與對照組相比模型組的負重游泳時長顯著降低(P<0.05)，說明模型組出現了運動性疲勞癥狀；富硒大豆低聚肽低/高劑量組以及大豆低聚肽組低/高劑量與模型組相比負重游泳時間顯著延長(P<0.05)，表明富硒大豆低聚肽與大豆低聚都具有一定的抗運動性疲勞能力，富硒大豆低聚肽低劑量組與大豆低聚肽組高劑量負重游泳時間無顯著差異(P>0.05)，富硒大豆低聚肽高劑量組效果最佳，負重游泳時長約提高了48.22%，表明富硒大豆低聚肽在高劑濃度下具有良好的抗運動性疲勞能力。

表1 小鼠體重變化及負重游泳時間

2.3 小鼠體內生化指標

機體在運動過程中，為了滿足機體能量代謝的需求氧化代謝強度必然大大增加，這就導致機體內的活性氧自由基的必然增加，由于測量血液和組織中自由基水平比較困難，而檢測血液和組織中抗氧化酶則相對簡單，以此來間接反映機體內自由基蓄積水平，從而判斷機體疲勞程度。

2.3.1 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶是氧自由基的唯一底酶，它廣泛存在于體細胞中，能過通過歧化反應將活性氧自由基轉化成毒性相對較低的H2O2，從而起到基保護細胞膜系統結構與功能完整性的作用[15]。在本實驗中，模型組中超氧化物歧化酶的活性顯著低于對照組(P<0.05)，從統計結果發現大豆低聚肽低劑量組SOD活性雖高于模型組但差異不顯著(P>0.05),富硒大豆低聚肽低劑量組與大豆低聚肽低劑量組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于模型組(P<0.05)，富硒大豆低聚肽高劑量組與大豆低聚肽高劑量組顯著高于模型組(P<0.05)，分別提高了28.42%、12.78%。

2.3.2 谷胱甘肽過氧化物酶

谷胱甘肽過氧化物酶以谷胱甘肽為底物，其主要抗氧化機制是將體內的H2O2高效還原成H2O，從而免受組織和細胞免受氧化損傷[16]。在本實驗中，模型組中谷胱甘肽過氧化物酶的活性顯著低于對照組(P<0.05)，富硒大豆低聚肽低劑量組與大豆低聚肽低劑量組與模型組相比未能顯著提高GSH-Px酶活性(P>0.05)，與大豆低聚肽高劑量組也無顯著差異(P>0.05)，但富硒大豆低聚肽高劑量組和大豆低聚肽高劑量組與模型組相比分別提高了23.85%和10.70%，具有統計學差異(P<0.05)。富硒大豆低聚肽中的硒代半胱氨酸能夠作為GSH-Px的活性中心，使GSH-Px活性的提高。此外，人體組織不能合成硒代蛋氨酸[17]，Navarro等[18]也發現硒代蛋氨酸也具有較好恢復GSH-Px活性的作用。

2.3.3 丙二醛

丙二醛的過量堆積會致使組織與細胞的過氧化損傷，它是一種由機體過剩自由基導致的不飽和脂肪酸形成的脂質過氧化物，可用以評估自由基所引起的脂質過氧化程度[19]。模型組小鼠血清中丙二醛的含量顯著高于對照組(P<0.05)，四組劑量組均能使小鼠血清中丙二醛的含量顯著低于模型組(P<0.05)，其中富硒低聚肽高劑量組MDA含量最低，脂質抗過氧化能力最強，約降低了23.43%，表明富硒低聚肽在高劑量組下抗運動性疲勞效果良好。

表2 小鼠血清生化指標

2.3.4 肌糖原與肝糖原的變化

研究表明由運動所導致的體力耗盡與肌糖原的消耗同步進行，而為了維持運動狀態所需的血糖水平會逐漸消耗肝糖原，使肝糖原含量降低[20]。肌糖原與肝糖原的變化結果見表3，通過對照組與模型組小鼠運動后肝糖原和肌糖原含量可以發現，LA與LG的數據結果相似，運動性疲勞會導致小鼠肝糖原與肌糖原含量顯著降低(P<0.05)，四組劑量組均能夠使小鼠的肝糖原與肌糖原含量升高，但兩組低劑量組未能使LG和LA含量與模型組產生顯著性差異(P>0.05)，富硒低聚肽高劑量組LG和LA含量顯著高于其余三組劑量組。

表3 小鼠肌糖原及肝糖原

3 結論

實驗采用了超濾輔助雙酶酶解法制備了富硒大豆低聚肽，并在運動性疲勞小鼠模型下，采用負重力竭游泳實驗以及相關生化指標對四組劑量組的抗疲勞效果進行評估。其中富硒大豆低聚肽高劑量組力竭游泳時間最長約為(37.47±1.33)min，小鼠體內血液生化指標的結果總體顯示該劑量組具有最佳的抗氧化活性，這主要是由于攝入的硒元素能夠參與體內抗氧化酶的合成，提高了抗氧化物酶的酶活，從而延緩了由于脂質過氧化而產生的疲勞；肌糖原與肝糖原的含量表明該劑量組能使小鼠具有更高的糖原儲備，因而可以通過消耗更多糖原提供能量，從而提高了小鼠的抗疲勞能力。