不同儲藏年限稻谷真菌群落多樣性與優勢菌屬探究

葛志文 周建新 方 勇 王光宇 邱偉芬

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

稻谷是我國三大主糧之一，在生產、消費與安全儲藏方面一直備受關注[1,2]。安徽省是我國稻谷主產地之一，屬于典型的濕潤區，高溫高濕氣候增加了儲藏稻谷霉變的風險。此外，稻谷在收獲和運輸過程中，與土壤、空氣、水等自然物質和機械接觸，攜帶大量的微生物進入儲藏期[3-5]。儲藏過程中適宜的溫濕度環境，有利的促進了真菌的生長繁殖與代謝[6,7]。產毒真菌的存在易導致大量真菌毒素產生，不僅破壞稻谷安全與品質，甚至威脅消費者健康，引發致癌、致畸、致突變等病理反應[8]。

目前關于儲藏稻谷真菌區系的研究，主要采用傳統平板菌落計數法和直接計數法[9]。然而，只有可培養真菌才能在培養基中生長，但它們僅占真菌總數的1%左右[10,11]，不能完全反映真菌區系分布。Illumina MiSeq測序法由于能對不同環境[12]中的真菌群落進行全面的檢測，包括可培養與不可培養真菌，如植物根際[13,14]，土壤[15,16]，深海沉積物等[17,18]，因此，近年來在多個領域研究中得到廣泛應用。

本研究先后對新入庫、儲藏1年、儲藏2年及儲藏3年的稻谷樣品進行了采集，采用Illumina MiSeq測序法，對儲藏稻谷樣品進行了DNA總序列測定，進一步全面深入了解不同儲藏年限稻谷樣品真菌群落多樣性及優勢菌屬分布，以期為有效采取稻谷儲藏霉變防控措施，創新防控技術提供更充分的理論依據，確保儲藏稻谷的安全與品質。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集

從安徽省國屬糧庫中采集樣品。稻谷在(20±5) ℃和50%±5%相對溫濕度條件下儲藏，含水量低于12%。先后對新入庫、儲藏1年、2年以及3年的稻谷樣品通過三層五點法進行采集，每個樣品重復采集三次，共得12個樣本。新入庫、儲藏1年、儲藏2年及儲藏3年稻谷樣品分別編號為S0-1，S0-2，S0-3；S1-1，S1-2，S1-3；S2-1，S2-2，S2-3；S3-1，S3-2，S3-3。

1.1.2 試劑

真菌基因組DNA試劑盒、Miseq v3試劑盒、AgencourtAMPure XP核酸純化磁珠、TransStart?Top Taq DNA Polymerase kit、dNTP mix。

1.2 實驗儀器

Eppendorf 5810R離心機，WH-2微型旋渦混合儀，AB 2720 Thermal Cycler，Invitrogen qubit3.0分光光度計，安捷倫2100 生物分析儀，Nanodrop 2000檢測儀，光照測序儀，ABI 2720型熱循環器。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取和PCR擴增

DNA提取步驟按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書完成，將提取的總DNA加入到50 μL緩沖液中，-80 ℃儲存備用。擴增真菌ITS 1區所選用的引物為：ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。每個樣本擴增三次，以標準真菌基因組DNA混合物作為陽性對照。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，循環25 次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。將所得PCR產物在Illumina MiSeq臺式測序機上運行。

1.3.2 操作分類單位聚類和物種注釋

對下機原始序列數據進行質量過濾，以獲得高質量序列[19]。通過UPARSE軟件將具有97%以上相似性的序列分配給相同的可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。每個OTU選擇對應的代表序列，進行物種注釋。

1.3.3 多樣性和統計分析

以OTU數量，Chao 1指數，ACE指數，Shannon指數，Simpson指數和覆蓋度為指標，分析各樣品的α多樣性。參照Ramette[20]的方法，通過主成分分析比較樣品間β多樣性，根據樣本OTU繪制各分類水平物種豐度圖及熱圖。

1.4 數據處理與分析

數據均采用 Excel 2016 和 Origin 8.5 數據統計軟件進行數據處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 測序數據優化及統計

對原始下機數據進行質量控制，擴增子測序共產生2 071 941個序列數，序列平均長度為242.49 bp，統計有效數據見表1。S0稻谷樣品有效序列數最大，其優化序列數占比也最高，達98.46%；S1稻谷樣品的序列數次之，S2稻谷樣品的序列數最少，優化序列數占比分別為98.38%、97.38%；S3稻谷樣品的序列數較S2稻谷樣品序列數略有增加，優化序列數占比為97.83%。S2序列數與S0、S1、S3序列數差異顯著(P<0.05)，表明儲藏期真菌群落數量在儲藏期逐漸減少后又有所增加。

表1 不同儲藏年限稻谷樣品DNA擴增序列統計

根據物種生物學理論，將稻谷樣品中微生物種類分為界、門、綱、目、科、屬、種六個等級，如表2，每列表示樣品在對應分類學水平上的OTU個數。結果發現，在每個分類學水平上，S0稻谷真菌群落中微生物種類對應最多，而S3稻谷真菌群落中微生物種類數最少，整體順序為S0>S2>S1>S3，且S0與S2，S1與S3之間差異不顯著，表明儲藏過程中真菌群落物種數發生變化，與儲藏年限不成正相關，隨儲藏年限增加群落物種數趨向減少。

表2 不同儲藏年限稻谷樣品物種注釋統計分析

2.2 儲藏稻谷真菌群落豐富度和多樣性指數分析

Shannon-Wiener曲線用于反映測序數據量的合理性及樣品中物種的豐富程度，如圖1所示，以抽取的序列數及其對應的多樣性指數構建曲線，以反映各樣本在不同測序數量時真菌群落物種多樣性。曲線已趨向平坦，說明測序數據量已接近飽和，可以反映樣本中絕大多數的微生物信息[21]。

圖1 四種不同儲藏稻谷以97%同源性OTU聚類的Shannon-Wiener曲線

表3中比較了12個儲藏稻谷樣品的樣本序列在文庫中的覆蓋度，最低為0.997 7，最高達到0.998 8，表明測序結果能表達樣品的完整多樣性。Chao1、ACE反映了不同年限儲藏稻谷樣品真菌群落的物種豐富度差異，比較知S0稻谷真菌群落的Chao1和ACE值均最大，表明其真菌群落物種豐富度最大，S3稻谷真菌群落物種豐富度最小。Shannon指數越大，表明真菌群落的物種多樣性越大，Simpson指數則與之相反。S0稻谷真菌群落的Shannon多樣性指數值為3.29，Simpson指數值為0.079。稻谷儲藏1年后，其真菌群落物種多樣性有所下降，達3.17，儲藏期延長，其真菌群落種類先增加后減少。S2稻谷真菌群落Shannon多樣性指數最大，平均值達3.38，對應的Simpson指數最小，為0.067。在儲藏3年后，真菌群落物種多樣性大大降低，Shannon多樣性數值僅為2.08。正如前人研究[22]，稻谷新入庫時攜帶大量田間真菌，微生物群落種類豐富，在進入儲藏期后，田間真菌逐漸被儲藏真菌替代，儲藏真菌逐漸增加。但因儲藏條件的控制，儲藏真菌生長受到抑制，隨儲藏年限的增加而不斷減少[23，24]。

表3 儲藏稻谷真菌群落多樣性指數統計分析

2.3 儲藏稻谷真菌群落組成與多樣性分析

根據測序結果及物種注釋結果，在屬和種水平上對物種結構進行統計分析并構建對應的豐度譜。按生物分類學，4種儲藏稻谷真菌群落可分為5個門、24個綱、69個目、132個科、232個屬，336個種。

由圖2可知，不同儲藏年限稻谷樣品的菌屬結構及相對豐度比各有不同。S0稻谷樣品中假絲酵母菌屬(Candida)，內生菌屬(Hypocreales)，盤蛇孢屬(Ophiosphaerella)和帚枝霉屬(Sarocladium)是優勢菌屬，相對豐度為19.83%、14.33%、11.90%和3.24%。S1稻谷樣品中曲霉屬，帚枝霉屬，內生菌屬和盤蛇孢屬為優勢菌屬，相對豐度為12.70%、7.42%、7.09%和3.69%。S2稻谷樣品中內生菌屬，曲霉屬，盤蛇孢屬，帚枝霉屬和節擔菌屬(Wallemia)為優勢菌屬，其相對豐度為14.91%、11.30%、8.28%、8.00%和5.84%。S3稻谷樣品中內生菌屬，節擔菌屬，盤蛇孢屬和曲霉屬為優勢菌屬，其相對豐度為57.43%、8.55%、6.41%和3.98%。由此可知，稻谷儲藏期不同，優勢菌屬不同，進入儲藏期后曲霉屬一直為優勢菌屬之一。曲霉菌屬在新入庫時含量相對較少，進入儲藏期時，隨著儲藏時間的延長有相應的增加，隨后又呈現逐漸下降的趨勢。

圖2 不同儲藏年限稻谷的真菌相對豐度(屬水平)

不同儲藏年限稻谷樣品的菌種組成及相對豐度比也各有不同。從圖3知，S0稻谷樣品中物種種類數最多，主要菌種是肉座菌(Hypocrealessp)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)，格孢(Ophiosphaerellaagrostidis)和中型假絲酵母(Candidaintermedia)，其相對豐度占比為14.33%、12.03%、11.90%和7.58%。S1稻谷樣品中主要菌種分別是稻帚枝霉(Sarocladiumoryzae)，肉座菌，帚狀曲霉(Aspergilluspenicillioides)和格孢，其相對豐度占比為7.29%、7.09%、5.01%和3.69%。S2稻谷樣品中主要菌種分別是肉座菌，格孢，稻帚枝霉和帚狀曲霉，其相對豐度占比為14.91%、8.28%、7.82%和7.77%。S3稻谷樣品中物種種類數最少，主要菌種分別是肉座菌，格孢，稻帚枝霉和帚狀曲霉，其相對豐度占比為57.43%、6.41%、2.71%和1.79%。此外，結果發現培養基易生長菌株黃曲霉(Aspergillusflavus)，交鏈孢霉(Alternariasp)依然是儲藏稻谷真菌群落中優勢菌株，由此可見，稻谷在入庫后不同儲藏期間均有曲霉和鏈格孢霉存在，這與平板培養法結果相一致[25]。培養基不易生長菌株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)，多育曲霉(Aspergillusproliferans)也被檢測出來，相較于傳統的平板菌落計數法，更加廣泛全面的反映了儲藏稻谷真菌群落的菌種組成。

圖3 不同儲藏年限稻谷的真菌相對豐度(種水平)

選擇相對豐度排行前25的物種進行制圖，并對4組樣本菌屬種類進行了聚類分析。由圖4可知，隨儲藏年限增加，主要菌屬假絲酵母菌屬(Gibberella)、曲霉屬(Aspergillus)、帚枝霉屬(Sarocladium)、鏈格孢屬(Alternaria)、枝孢霉屬(Cladosporium)、青霉屬(Penicillium)的相對豐度呈現不同變化。儲藏年限越長，儲藏稻谷中假絲酵母菌屬和鏈格孢屬的相對豐度增加，曲霉屬、帚枝霉屬、枝孢霉屬和青霉屬的相對豐度先增加后減少，表明稻谷在儲藏中其真菌群落結構發生變化，優勢菌群發生了明顯的演替，有研究者表明這與儲藏過程中稻谷的生理代謝產物積累，不同類型微生物代謝產物形成相互抑制有關[26，27]。

圖4 不同儲藏年限稻谷樣品屬水平熱圖分析

2.4 不同儲藏年限稻谷真菌群落間差異分析

Venn圖用于統計多個樣品中所共有和獨有的OTU數目，從而直觀的表現環境樣品的OTU數目組成相似性及重疊情況。

如圖5所示，S0、S1、S2、S3稻谷樣品真菌群落總OTU數分別為657、518、551、451。對比發現，S0稻谷具有的特性OTU數量最多，達222個，隨著儲藏年限增加，S1、S2、S3儲藏稻谷樣品真菌群落中具有的特性OTU數量逐漸減少，依次為117、113和75個。四種稻谷樣品真菌群落中共有的OTU數相對較多，達217個。由此可見，不同儲藏年限稻谷真菌群落存在很多相同物種和不同物種，群落間物種豐富度存在差異，且新入庫儲藏稻谷真菌群落物種豐富度遠大于儲藏期的稻谷樣品。

注：不同樣本分組用不同的顏色表示，不同顏色圓圈重疊的區域標注數字表示共有的OTU數。圖5 不同儲藏年限稻谷樣品OTU分布比較Venn圖

如圖6所示，基于不同儲藏年限稻谷樣品獲得的OTU豐度表進行主成分分析，以比較分析糧庫控溫儲藏環境下儲藏稻谷真菌群落間差異。第1、2主成分分別占總變異的70.242%和19.891%。由圖可知，不同儲藏年限稻谷樣品位置間均相對分散，其中S3稻谷樣品位置與其他儲藏年限稻谷樣品位置的相對分散最遠，表明其菌群物種多樣性與其他儲藏年限的稻谷樣品差異顯著，說明儲藏時間以及儲藏條件對稻谷真菌群落物種多樣性的變化有顯著影響。

圖6 不同儲藏年限稻谷樣品主成分分析圖

3 結論

隨儲藏年限增加，稻谷真菌群落多樣性發生變化，優勢菌屬也發生演替，優勢菌屬假絲酵母菌屬(Gibberella)和鏈格孢屬(Alternaria)的相對豐度增加，曲霉屬(Aspergillus)、帚枝霉屬 (Sarocladium)、 枝孢霉屬(Cladosporium)和青霉屬(Penicillium)的相對豐度先增加后減少，其均是儲藏稻谷中產真菌毒素高風險因子，應作為稻谷儲藏過程中的重點防控對象。

新入庫儲藏稻谷真菌群落物種豐富度遠大于儲藏期的稻谷樣品。各生物分類學水平上，新入庫稻谷真菌群落中微生物種類對應最多，且真菌群落多樣性與其他儲藏年限稻谷差異顯著(P<0.05)，儲藏3年稻谷真菌群落中微生物種類數最少。目前儲藏稻谷真菌群落中無法確認分類學信息的真菌在屬級占比達30.37%，種級占比達37.81%，后續實驗將對儲藏稻谷真菌群落中未知真菌種類鑒定、群落中菌屬特征及功能特性等展開進一步研究。