一株具有高效抑菌活性乳酸菌的分離鑒定及生長(zhǎng)特性研究

徐云鳳 張 欣 褚澤軍 張 萌 張 敏 陳俊亮

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

乳酸菌在自然界中分布廣泛，在各種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，尤其是酸菜中，常成為優(yōu)勢(shì)菌群[1]。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生乳酸、醋酸、甲酸等有機(jī)酸，降低環(huán)境體系的pH值，從而抑制多種食品腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)；此外，乳酸菌的其他代謝產(chǎn)物，如細(xì)菌素也具有抑菌作用[2]。鑒于乳酸菌的廣譜抑菌特性以及多種抑菌機(jī)理，其已成為開發(fā)微生物源天然防腐劑的潛在菌種[3]。目前，關(guān)于分離自發(fā)酵乳制品[4]、肉制品[5]和發(fā)酵蔬菜[6]等食品材料中乳酸菌多樣性的研究日益增多，但篩選出性能優(yōu)良的菌株仍是一項(xiàng)重要的工作。研究擬從內(nèi)蒙古地區(qū)家庭自制的酸菜中分離篩選乳酸菌，進(jìn)行初步鑒定及生長(zhǎng)特性研究，并探討其對(duì)多種常見病原微生物的抑菌作用，從而篩選出具有高效抑菌作用的菌株，為其進(jìn)一步在發(fā)酵食品的生產(chǎn)和食品防腐保藏劑的開發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

酸菜樣品：家庭自制酸菜，取回后置于4 ℃冰箱備用，內(nèi)蒙古包頭市；

金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌ATCC 25922：河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；

MRS瓊脂、MRS肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

甘油、碳酸鈣：分析純，天津德恩化學(xué)試劑有限公司；

酸度計(jì)校正液：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

HBI乳酸菌生化鑒定條：青島海博生物技術(shù)有限公司；

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、引物、Taq Plus DNA聚合酶、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程(上海)有限公司；

細(xì)菌濾膜：0.22 μm孔徑，上海密粒膜分離技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：JY1002型，上海上天精密儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：WFJ7200型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：PYL-45型，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；

潔凈工作臺(tái)：SW-CJ-IF型，常州普天儀器制造有限公司；

冷凍離心機(jī)：HC-2518R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：BFGJ-23型，青島化工儀器設(shè)備有限公司；

普通光學(xué)顯微鏡：BA210型，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；

PCR儀：Veriti 96孔型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠；

酸度計(jì)：PHS-25型，杭州雷磁分析儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化 取適量的酸菜樣品于無(wú)菌生理鹽水中，震蕩搖勻后，進(jìn)行10-3～10-1的梯度稀釋，各吸取0.1 mL至MRS平板(含1%碳酸鈣)上[7]，用涂布棒涂布均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用肉眼觀察菌落形態(tài)，挑取疑似乳酸菌的單菌落轉(zhuǎn)接至新的MRS平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，重復(fù)操作3～4次，直至同一平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落形態(tài)一致，且無(wú)雜菌生長(zhǎng)。將純化后的菌株保存于20%甘油—MRS液體培養(yǎng)基中，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株生理生化特征測(cè)定 對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色和顯微觀察，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和GB 4789.35—2016，結(jié)合乳酸菌生化鑒定試劑盒操作說(shuō)明，進(jìn)行碳水化合物(七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖和乳糖)反應(yīng)測(cè)定[8]。

1.2.3 基于16S rDNA的菌株鑒定

(1) 基因組DNA的提取：參照DNA抽提試劑盒說(shuō)明書。

(2) PCR擴(kuò)增：以菌株的基因組DNA為模板，采用通用引物對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；57 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸90 s，30次循壞；72 ℃延伸8 min。

(3) 瓊脂糖凝膠電泳：使用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠，以1× TAE為電泳緩沖液，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳條件為150 V，100 mA，20 min。

(4) 測(cè)序結(jié)果分析：菌種測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。16S rDNA 序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行序列比對(duì)分析，利用MEGA 6.0軟件按鄰近算法(Neighbor-Joining)，自展值 (bootstrap)為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[9]。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

(1) 指示菌平板的制備：用接種環(huán)分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在TSA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取部分單個(gè)菌落于無(wú)菌生理鹽水中，測(cè)定吸光度值，調(diào)節(jié)OD600 nm值至0.5，加入無(wú)菌生理鹽水稀釋100倍(含菌量約為106CFU/mL)，吸取100 μL于TSA培養(yǎng)基上涂布均勻后，放置牛津杯。

(2) 乳酸菌代謝產(chǎn)物的制備：將保存的菌種接種至MRS瓊脂平板上進(jìn)行活化，挑取單菌落于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。8 000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm孔徑細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾制成無(wú)菌濾液，所得無(wú)菌濾液即為乳酸菌代謝產(chǎn)物[10]。

(3) 乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌試驗(yàn)：使用牛津杯法測(cè)定抑菌圈大小。向牛津杯(8 mm×6 mm×10 mm)中加入200 μL除菌的乳酸菌上清液，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示[11]。指示菌分別為金黃色葡萄球菌ATCC 25923和大腸桿菌ATCC 25922。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力測(cè)定 將菌株活化后，接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，將其OD600 nm值調(diào)至0.5，取50 μL加入到500 mL無(wú)菌新鮮的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，0～24 h內(nèi)每間隔2 h取樣，24～48 h內(nèi)每間隔4 h取樣，測(cè)定其在600 nm處吸光度值，同時(shí)，用pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基的pH值[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選、鑒定

由圖1可知，疑似菌株在MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，其菌落形態(tài)為圓形、乳白色、有光澤、中間凸起、表面光滑、邊緣整齊且有溶鈣圈，具有明顯的乳酸菌形態(tài)學(xué)特點(diǎn)[13]；該菌株為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，無(wú)芽孢和鞭毛。生化鑒定結(jié)果表明，其對(duì)所測(cè)試的10種碳水化合物的反應(yīng)均為陽(yáng)性。

圖1 乳酸菌的菌落和菌體細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征Figure 1 Morphological characteristics of the colonies and cells of LAB

由圖2可知，瓊脂糖凝膠電泳圖上觀察到大小約為1 500 bp 的特異性條帶，經(jīng)測(cè)序得到菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度剛好為1 500 bp。通過(guò)BLAST序列同源性比對(duì)，與之相似度達(dá)100%的菌株為植物乳桿菌；取相似度達(dá)100%的序列和其他乳桿菌的序列共11個(gè)16S rDNA序列，利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)。由圖3可知，該乳酸菌與植物乳桿菌處于同一個(gè)小分支，同源性最高，結(jié)合細(xì)菌的菌落形態(tài)和生理生化特征，該菌株被鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

圖2 菌株的16S rDNA電泳圖Figure 2 Electrophoresis of 16S rDNA of the strain

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

2.2 抑菌試驗(yàn)

由圖4可知，乳酸菌代謝產(chǎn)物上清液對(duì)兩種指示菌均有良好的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈平均直徑分別為(15.5±0.3)，(14.5±0.2) mm。一般而言，乳酸菌代謝產(chǎn)物如細(xì)菌素，大多僅僅抑制親緣關(guān)系相近的菌種或多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[14]。而試驗(yàn)分離的菌株，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)有較好的抑菌效果，而且對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)同樣表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，可能是由于乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生了有機(jī)酸、過(guò)氧化氫或細(xì)菌素等物質(zhì)，通過(guò)協(xié)同作用有效地抑制了指示菌的生長(zhǎng)。

2.3 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸特性

由圖5可知，菌株的生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型，可以觀察到明顯的延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。其延滯期約為8 h，該時(shí)期細(xì)菌數(shù)量基本無(wú)變化；隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，此時(shí)期生長(zhǎng)迅速，分裂旺盛，細(xì)菌數(shù)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)；18 h后，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)菌株從接種至培養(yǎng)8 h時(shí)，pH值變化很小；當(dāng)培養(yǎng)8～24 h時(shí)，pH值下降速度較快，說(shuō)明此期間細(xì)胞代謝活躍，生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞繁殖能力強(qiáng)，為產(chǎn)酸的主要時(shí)期；從培養(yǎng)第24 h開始pH值變化趨緩，最低pH值為3.57。

圖4 乳酸菌無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)指示菌的抑制效果Figure 4 Inhibitory effects of the cell-free metabolites supernatant of LAB against indicator bacteria

圖5 菌株的生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酸曲線Figure 5 Curves of growth and acid producing of the strain

3 結(jié)論

從內(nèi)蒙古地區(qū)家庭自制的酸菜中分離得到了一株乳酸菌，經(jīng)生理生化鑒定和16S rDNA序列同源性分析，該菌株被鑒定為植物乳桿菌；抑菌試驗(yàn)表明，該菌株的代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有良好的抑制效果；菌株在適宜條件下培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和產(chǎn)酸的主要時(shí)期。試驗(yàn)僅探討了分離菌株的抑菌效果，關(guān)于抑菌物質(zhì)成分與其生物學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究，以及具體的作用機(jī)理有待進(jìn)一步闡釋。