柴貝止癇湯在大鼠體內主要入血成分及其藥代動力學研究

董笑克 劉金民 李中浩 袁斯遠 王凱悅 黎莉莉 鄭香春

中國有900萬以上癲癇患者，約30%因抗癇藥物難以控制發作而成為耐藥性癲癇。單一靶點的藥物很容易產生耐藥，對耐藥性癲癇的治療難以發揮應有的療效。柴貝止癇湯是劉金民教授在《醫學心悟》定癇丸及《傷寒論》柴胡加龍骨牡蠣湯的基礎上，結合王永炎院士及個人多年臨證經驗所創制，由柴胡、天麻、浙貝母、法半夏、石菖蒲、牡蠣和地龍7味藥組成，具有疏肝理氣、化痰息風、醒神開竅的功效。團隊通過大量臨床及基礎研究發現柴貝止癇湯具有良好的抗癇療效及安全性，具有較高的臨床價值及研究意義[1-8]。為了進一步挖掘其抗癇作用物質基礎，本研究通過借助超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)-串聯質譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)技術以及氣相色譜(gas chromatography，GC)- MS/MS技術，分析柴貝止癇湯主要吸收入血成分，并借助DAS軟件計算其藥代動力學參數，為中藥治療耐藥性癲癇有效成分的挖掘開發奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑

柴貝止癇湯由柴胡12 g、天麻15 g、浙貝母9 g、法半夏9 g、石菖蒲9 g、煅牡蠣30 g、地龍6 g組成，購自北京中醫藥大學東方醫院藥劑科，每劑中藥統一煎至100 mL。

貝母素甲(110750)、貝母素乙(110751)、貝母辛(111892)、柴胡皂苷A(110777)、柴胡皂苷D(110778)、天麻素(110807)、香草醛(100093)、原兒茶醛(110810)、胡蘆巴堿(110883)、α-細辛醚(100298)、β-細辛醚(112018)、普萘洛爾(100783)標準品購自中國食品藥品檢定研究院，柴胡皂苷C(B20149)、對羥基苯甲醛(B20327)、天麻苷元(對羥基苯甲醇，111970)、檸檬醛(B25317)、茴香腦(B20579)、細辛醛(B21345)、甲苯磺丁脲(B26427)標準品購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器

DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀；Thermo Q EXACTIVE質譜儀；氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS/MS)，液相部分：島津GC-2010 Plus，進樣器：AOC-5000 Plus，質譜部分：MS/MS；色譜柱：RTX-5MS(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；控制軟件與數據處理系統為島津公司高效化學工作站(GC-MS/MS Real Time Analysis)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠6只，體重(200±10)g，由北京維通利華實驗技術有限公司提供，合格證號：SYXK(京)2011-0024。動物飼養于北京中醫藥大學東方醫院動物實驗中心，飼養級別為SPF級，3只/籠，保證正常光照節律、溫濕適度、環境安靜，正常大鼠生長繁殖飼料飼養，自由進食和飲水。

1.4 柴貝止癇湯有效成分收集

柴貝止癇湯由柴胡、天麻、浙貝母、法半夏、石菖蒲、牡蠣和地龍7味藥組成，通過檢索相關文獻和篩選藥物中含量較大、研究較多、對癲癇治療可能存在主要作用的化學成分，鎖定目標成分17種，分別為：貝母素甲(verticine，來源：浙貝母)、貝母素乙(verticinone，來源：浙貝母)、貝母辛(貝母辛堿，peimisine，來源：浙貝母)、柴胡皂苷A(saikosaponin A，來源：柴胡)、柴胡皂苷D(saikosaponin D，來源：柴胡)、柴胡皂苷C(saikosaponin C，來源：柴胡)、對羥基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde，來源：天麻)、天麻苷元(對羥基苯甲醇，p-hydroxybenzoic alcohol，來源：天麻)、天麻素(gastrodin，來源：天麻)、香草醛(vanillin，來源：天麻)、原兒茶醛(protocatechualdehyde，來源：天麻)、胡蘆巴堿(trigonelline，來源：天麻)、檸檬醛(citral，來源：半夏)、茴香腦(anethole，來源：半夏)、α-細辛醚(α-細辛腦，α-asarone，來源：石菖蒲)、β-細辛醚(β-細辛腦，β-asarone，來源：石菖蒲)、細辛醛(asarylaldehyd，來源：石菖蒲)。

1.5 干預方式及樣品采集

所有大鼠適應性飼養1周后，禁食10小時，自由飲水，取大鼠眶靜脈取血約0.2 mL，記為0分鐘。給予大鼠柴貝止癇湯9 mL/kg(折合生藥藥量8.125 g/kg)灌胃，分別于灌胃后15min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4h眼眶取血0.2 mL于抗凝管中，4℃離心機3000 rpm離心10 min分離血漿，-80℃保存以進行后續檢測。

1.6 血漿樣品處理

1.6.1 UPLC-MS/MS檢測樣品前處理 將血漿加入3倍沉淀劑沉淀蛋白，10000 rpm離心10 min后，取100 μL上清液進樣5μL于液質，進行UPLC-MS/MS分析。

1.6.2 GC-MS/MS檢測樣品前處理 取待測血漿樣品50 μL，加入含內標的乙酸乙酯：三氯甲烷(8∶2)萃取劑150 μL，渦旋混勻60秒，13000 rpm離心10 min，吸取上清液100 μL，吸取1 μL進行GC-MS測定。

1.7 UPLC-MS/ MS分析條件

1.7.1 UPLC條件 Thermo Syncronis C18，1.9 μm，2.1×100 mm色譜柱，液相條件：(1)A：水(含0.1%甲酸及2 mmoL/L甲酸銨)，D：乙腈；梯度洗脫，分析時間0～8min，進樣量5 μL，流速0.25 mL/min。梯度條件見表1。

表1 UPLC檢測梯度條件

1.7.2 MS/MS分析條件 電噴霧電離源ESI(+)；監測模式：二級數據依賴性掃描(Targeted-SIM)；噴霧電壓：2800V；蒸發溫度：350oC；鞘氣：35Arb；輔助氣：10Arb；毛細管溫度：320oC；S-lens RF：50。

化合物參數：(1)原兒茶醛(-)：137.02442，貝母素甲(+)：432.34722，貝母辛(+)：428.31592，香草醛：151.04007，貝母素乙(+)：430.33157，對羥基苯甲醛(-)：121.02950；(2)柴胡皂苷A(-)：779.45871，天麻素(-)：321.07355，柴胡皂苷C(-)：925.51662，天麻苷元(-)：123.04515，柴胡皂苷D(-)：779.45871，普萘洛爾(IS+)：260.16451，甲苯磺丁脲(IS-)：269.09654。標曲濃度范圍：0.001～500 ng/mL。

1.8 GC-MS/MS條件

載氣為He氣，恒流模式，流速為1 mL/min，進樣量1 μL，氣化室溫度250℃，柱溫為程序升溫，起始溫度為80℃，維持1 min，30℃/min升至250℃，維持1 min，30℃/min升至300℃，維持1 min，總測定時間10.33 min。MSD檢測為MS/MS模式。

1.9 統計學處理

血漿濃度數據采用DAS 2.0軟件進行計算參數：AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、MRT(0-∞)、t1/2、Tmax、Cmax。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 標準品色譜圖及曲線線性范圍 通過UPLC-MS/MS檢測標準品：貝母素甲、貝母素乙、貝母辛、柴胡皂苷A和D、柴胡皂苷C、對羥基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原兒茶醛標準品色譜圖。見圖1。繪制標準曲線，標曲濃度范圍：0.001～500 ng/mL，標準曲線回歸方程R2>0.998，提示在此范圍內線性關系良好，可滿足藥物濃度定量分析的要求。

注：A：貝母素甲；B：貝母素乙；C：貝母辛；D：柴胡皂苷A和D；E：柴胡皂苷C；F：對羥基苯甲醛；G：天麻苷元；H：天麻素；I：香草醛；J：原兒茶醛；K：甲苯磺丁脲內標；L：普萘洛爾內標

注：A：胡蘆巴堿；B：檸檬醛；C：茴香腦；D：α-細辛醚；E：β-細辛醚；F：細辛醛

GC-MS/MS檢測標準品胡蘆巴堿、檸檬醛、茴香腦、α-細辛醚、β-細辛醚、細辛醛色譜圖，見圖2，繪制標準曲線，標曲濃度范圍：0.01～500 ng/mL，標準曲線回歸方程R2>0.996，提示在此范圍內線性關系良好，可滿足藥物濃度定量分析的要求。

2.1.2 日內、日間精密度及回收率 柴貝止癇湯主要單體成分：貝母素甲、貝母素乙、貝母辛、柴胡皂苷A和D、柴胡皂苷C、對羥基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原兒茶醛、胡蘆巴堿、檸檬醛、茴香腦、α-細辛醚、β-細辛醚、細辛醛17個標準品日內精密度和日間精密度RSD<5%，回收率在97%～103%，符合定量分析要求。

2.2 柴貝止癇湯不同時間點入血成分濃度定量檢測

17種標準品檢測柴貝止癇湯不同時間點入血成分，檢測出15種化合物，分別是貝母素甲、貝母素乙、貝母辛、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、對羥基苯甲醛、天麻苷元、天麻素、香草醛、原兒茶醛、胡蘆巴堿、茴香腦、α-細辛醚、β-細辛醚、細辛醛。檸檬醛及柴胡皂苷D在各個采血點均未檢測出，通過各個標準品回歸方程定量計算各化合物不同時間點濃度。見表2。

表2 柴貝止癇湯主要入血成分不同時間點濃度均值結果(ug/L)

2.3 柴貝止癇湯入血成分平均血漿藥-時曲線

采用DAS2.0軟件繪制柴貝止癇湯入血成分平均血漿藥-時曲線，血漿藥-時曲線呈現為一個單峰曲線，曲線在0.25小時達到最高峰。見圖3。

圖3 柴貝止癇湯入血成分平均血漿藥-時曲線

2.4 柴貝止癇湯入血吸收成分藥代動力學參數

通過DAS2.0軟件，分析柴貝止癇湯15種入血成分不同時間點的藥代動力學參數：AUC(0-t)、AUC(0-∞)、MRT(0-t)、MRT(0-∞)、t1/2、Tmax、Cmax，結果見表3。柴貝止癇湯15種入血成分入血含量由高到底排列依次為：天麻素、對羥基苯甲醛、胡蘆巴堿、天麻苷元、原兒茶醛、柴胡皂苷A、香草醛、細辛醛、貝母素乙、α-細辛醚、茴香腦、β-細辛醚、柴胡皂苷C、貝母素甲、貝母辛，含量顯著高于其他成分的天麻素、對羥基苯甲醛、胡蘆巴堿、天麻苷元等均為天麻的有效成分。15種入血成分Tmax多集中在0.25或0.5小時，t1/2分布范圍差異較大，其均值為4.28小時。

表3 柴貝止癇湯15種入血成分的藥代動力學參數

3 討論

癲癇屬于中醫“癇證”的范疇，現代醫家認為痰濁內阻，臟氣不平，陰陽偏勝，神機受累，元神失控是癲癇的關鍵病機。本團隊收集耐藥性癲癇患者的一般情況及中醫四診信息，應用因子分析法進行統計學分析，發現耐藥性癲癇患者以痰氣郁滯證所占比例最高[9]，認為理氣化痰是癲癇主要治則之一[10]，擬定柴貝止癇湯治療耐藥性癲癇證屬痰氣郁滯證患者。團隊通過隨機雙盲臨床對照試驗發現，在常規抗癇西藥的基礎上添加柴貝止癇湯治療，與單純采用抗癇西藥相比，患者癲癇發作頻次、癲癇積分、癲癇發作伴隨癥狀積分均較治療前顯著下降[2]。

此外，添加柴貝止癇湯治療耐藥性癲癇，對患者疲勞、發作恐懼、社會支持、藥物不良反應4項具有一定的改善作用[3]，隨著療程的延長，療效逐漸顯著，未發現不良反應[4]。動物實驗同樣證實了柴貝止癇湯具有抗癇作用[5-8]。然而中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑的特點，柴貝止癇湯中有效成分數量龐大，對組方藥效物質基礎的研究有助于篩選到柴貝止癇湯的主要效應成分，對組方精簡及抗癲癇新藥的研發就有重要的意義。

本研究發現了柴貝止癇湯的15個吸收入血成分，按照血藥濃度高低依次為天麻素、對羥基苯甲醛、胡蘆巴堿、天麻苷元、原兒茶醛、柴胡皂苷A、香草醛、細辛醛、貝母素乙、α-細辛醚、茴香腦、β-細辛醚、柴胡皂苷C、貝母素甲、貝母辛。其中排名前五位的天麻素、對羥基苯甲醛、天麻苷元、原兒茶醛均為天麻的主要吸收成分，天麻味甘平，歸肝經，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效，在柴貝止癇湯中為君藥，《神農本草經》記載其“味辛溫，主殺鬼精物，蠱毒，惡氣，久服益氣力，長陰肥健，輕身增年”。天麻是治療癲癇最常用的中藥之一，現代醫學研究表明天麻可以使戊四氮誘導的癲癇模型大鼠癲癇發作潛伏期延長、發作持續時間縮短，降低大鼠腦組織凋亡相關蛋白表達，發揮神經保護作用[11]。其他研究同樣證實了天麻的抗癲癇作用及神經保護作用[12]，其主要成分天麻素可以通過激活PI3K/AKT信號通路保護過氧化氫誘導的神經細胞氧化損傷[13]，干預中樞神經系統內興奮性或抑制性神經遞質釋放、調控Nrf2/ERK的表達，下調氧化應激酶類血紅素加氧酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等的作用、抑制膠質細胞產生神經炎癥因子白細胞介素、腫瘤壞死因子等以達到保護神經元的目的[14]。柴貝止癇湯中的其他入血吸收成分如α-細辛醚、β-細辛醚、原兒茶醛等同樣具有一定的抗癇作用[15-16]，并能調節突觸可塑性，一定程度改善認知功能[17]。胡蘆巴堿、柴胡皂苷等具有抗炎、抗氧化的作用，可抑制核因子κB信號通路發揮抗炎作用[18]。

本研究借助UPLC-MS/MS及GC-MS/MS技術發現了柴貝止癇湯的15個主要吸收入血成分及其藥代動力學特征，下一步可借助網絡藥理學等研究方法，對入血吸收成分的作用靶點及疾病治療靶點做相關性分析，以進一步揭示柴貝止癇湯抗癇作用的潛在物質基礎，并通過實驗研究加以驗證，為耐藥癲癇的治療及新藥研發提供基礎。