響應曲面法優化超聲協同復合酶法提取廣金錢草多糖工藝

黃 盼, 周改蓮,2*, 黃素琴, 王 倩, 謝雪婷, 王乃斌

(1.廣西中醫藥大學藥學院, 南寧 530020； 2.廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術中心, 南寧 530020)

廣金錢草為豆科植物廣金錢草Desmodiumstyracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分,又名廣東金錢草、落地金錢、銅錢草、馬蹄香等[1],其性涼,味甘淡,歸肝經、腎經和膀胱經,具有清熱除濕、利尿通淋的功效,常用于治療熱淋、砂淋、石淋、小便澀痛、水腫尿少、黃疽尿赤、尿路結石等[2]，為兩廣地產藥材,始載于《嶺南采藥錄》一書。廣金錢草的統一藥用名稱源于《嶺南草藥志》[3]。其化合物包含黃酮、生物堿、酚類、鞣質、多糖、揮發油、皂苷、有機酸等[4]。

多糖是自然界廣泛存在的一類天然有機大分子物質,也是生物機體的主要能量物質[5]。研究發現多糖具有抗腫瘤[6]、抗疲勞[7-8]、抗病毒[9]、抗氧化[10-11]、降血糖[12]、免疫調節[13]等作用。常用提取多糖的方法有熱水浸提法[14]和堿提法[15]。近年來微波輔助提取法[16]、酶法[17]、超聲輔助提取法[18]的應用越來越多,它們的提取效果均優于熱水浸提法和堿法。酶法不僅能有效破壞細胞壁,使較多的多糖溶出,而且反應條件溫和,不會破壞多糖的生物活性。超聲輔助提取是利用超聲空化作用,增強細胞滲透效應和毛細管效應,使有效成分溶出,此法可縮短提取時間和提高提取率,避免高溫對有效成分的影響。目前中外對廣金錢草多糖的研究內容較少,多集中于體內外研究以及提取工藝方面[6-13]。崔健敏等[19]正交試驗優化了熱水浸提法提取廣金錢草多糖的最佳工藝條件；程軒軒等[20]運用響應面法對酶法提取廣金錢草多糖的工藝進行了研究探索；李容等[21]采用超聲法提取廣金錢草多糖,通過單因素試驗和正交試驗優化廣金錢草多糖提取的最佳工藝。目前復合酶結合超聲法提取多糖的研究較多[22-23],且提取效率相對很高,方法較為完善。因此，基于前任學者的基礎及啟迪,將超聲法與復合酶法進行協同,進而提取廣金錢草多糖,并對其工藝進行最佳優化；應用加權評分法,以廣金錢草提取物中多糖得率和多糖含量為綜合得分,根據Box-Behnken試驗設計原理,采用響應面法建立二次多項式回歸方程的預測模型,構建以綜合得分為響應值的響應曲面和等高線圖,以期為廣金錢草多糖的工藝優化研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與試劑

纖維素酶(活力3 u/mg,北京索萊寶科技有限公司)、果膠酶(活力40 u/mg,北京索萊寶科技有限公司)、木瓜蛋白酶(活力40 u/mg,北京索萊寶科技有限公司)、苯酚(20160/11,國藥集團化學試劑有限公司)、濃硫酸(2019121601,成都市科隆化學品有限公司)、一水合檸檬酸(20180522,成都金山化學試劑有限公司)、磷酸二氫鈉溶液(20180408,天津大茂化學試劑廠)、無水葡萄糖(99.9%,110833-201707,中國食品藥品檢定研究院)；95%乙醇(2019080202,成都市科隆化學品有限公司)、石油醚(2017071701,成都市科隆化學品有限公司)、正丁醇(2019102401,成都市科隆化學品有限公司)，均為分析純。

廣金錢草藥材購買于南寧市太華藥業股份有限公司,經廣西中醫藥大學廖月葵副教授鑒定為廣金錢草Desmodiumstyracifolium的地上干燥部分。

1.1.2 主要儀器設備

主要儀器設備有UV-1780紫外分光光度計(島津儀器有限公司)、HWS-26電子恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司)、SHB-B95循環水真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)、KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、SQP電子分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 廣金錢草多糖的提取及測定

取烘干的廣金錢草放入粉碎機中進行粉碎,粉碎后過2號篩,加石油醚脫脂回流2 h,揮干,精確稱取3.0 g,按照一定的料液比加入一定的去離子水,在一定的溫度下超聲提取一定時間,在最佳超聲波條件提取結束后,加入緩沖液和1%濃度的復合酶(纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1),按照一定的pH、酶解溫度、酶解時間于水浴鍋進行復合酶解實驗,沸水浴滅酶,過濾,減壓濃縮。然后加95%的乙醇溶液,醇沉提取液離心,得到多糖沉淀,用蒸餾水溶解多糖沉淀。加入一定體積正丁醇-氯仿,攪拌10 min,將離心機設置成4 000 r/min,離心15 min,棄沉淀,得到多糖溶液。

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法。用100 mL容量瓶將多糖溶液稀釋100倍,再將其稀釋10倍,往2.0 mL稀釋后的多糖溶液中加入配好的5%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL,進行15 min、100 ℃的水浴加熱,完成后冷卻。在波長490 nm測定吸光值。

1.2.2 標準曲線的繪制

準確稱取10.0 mg減壓干燥至恒重的葡萄糖,加水溶解定容至100 mL,搖勻,制成0.1 mg/mL的對照品溶液。分別精確吸取0.0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.2、1.4 mL葡萄糖對照品溶液置于具塞試管中,分別用蒸餾水補至2.0 mL。依次加入5.0%苯酚溶液1.0 mL,搖勻；緩慢加濃硫酸5.0 mL,搖勻,室溫靜置,15 min。以蒸餾水2.0 mL同上操作加苯酚和濃硫酸顯色,作為空白對照。在490 nm處測吸光度,以溶液濃度X為橫坐標,吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程為y=63.529 41x+0.002 40，R2=0.999 8。

苯酚溶液的制備:取苯酚5.0 g,加水100 mL,使其完全溶解后放置于棕色試劑瓶中避光保存。

1.2.3 綜合得分的計算

多糖提取率=cVN/m×100%

(1)

式(1)中：c為濃度，mg/mL；V為體積，mL；N為稀釋倍數；m為取樣量，mg。

多糖得率X和多糖含量Y的計算式為

X=100%×粗多糖干品質量(mg)/原料質量(mg)

(2)

Y=100%CDV/M

(3)

式中：C為根據標準曲線計算出待測液的多糖濃度，mg/mL；D為稀釋倍數；V為提取液定容體積，mL；M為干燥后所得粗多糖的質量，mg。

加權評分法:把各項與該列最大值相除再乘以100為該項得分,根據多糖得率X和多糖含量Y的作用,確定兩者的權重系數,對兩項指標進行加權求和,通過公式Z=0.5X+0.5Y可得綜合得分Z。

1.2.4 超聲波提取工藝優化

準確稱取3.0 g脫脂樣品于三角瓶中，各6份,在超聲波200 W的條件下,分別研究液料比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 mL/g)、超聲時間(60、70、80、90、100 min)、超聲溫度(20、30、40、50、60 ℃)對廣金錢草多糖綜合得分的影響。

1.2.5 超聲波協同復合酶法提取條件的優化

準確稱取3.0 g脫脂樣品于三角瓶中，各6份,在超聲波提取最佳條件下,加入緩沖液和復合酶,按照一定的pH(4.5、5、5.5、6、6.5)、酶解溫度(40、50、60、70、80 ℃)、酶解時間(50、55、60、65、70 min)于水浴鍋進行復合酶解實驗,考察pH、酶解溫度、酶解時間對廣金錢草多糖綜合得分的影響。

1.2.6 超聲波協同復合酶法響應面實驗設計

采用響應面優化法設計中心組合試驗, 在單因素試驗的基礎上, 選擇對廣金錢草多糖影響較大的3個因素,以液料比A、超聲時間B及酶解pHC為實驗因素,采用三因素三水平的Box-Behnken法進行試驗,以廣金錢草多糖綜合得分為響應值, 進行響應面分析。響應面分析因素水平如表1所示。

表1 響應面分析因素水平Table 1 Response surface analysis factor level

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 液料比對廣金錢草多糖綜合得分的影響

液料比A對廣金錢草多糖綜合得分Z的影響如圖1所示。當溶劑加入量較少時,多糖的綜合得分隨液料比的加大而升高。當液料比升至40∶1 mL/g時,多糖綜合得分升高至最高值,達98.16。隨著液料比的升高,綜合得分出現下降趨勢,可能隨著液料比的增加,底物濃度降低進而導致多糖提取量的減少,多糖分子被溶出的同時其他雜質也被溶解,而大量雜質分子的存在會擠占多糖的溶出空間,導致廣金錢草多糖的綜合得分不升反而下降,因此液料比應該選擇40∶1 mL/g。

圖1 液料比對廣金錢草多糖提取綜合得分的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the comprehensive score of extraction of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.2 超聲時間對廣金錢草多糖綜合得分的影響

超聲波超聲時間B對廣金錢草多糖綜合得分Z的影響如圖2所示。在一定時間范圍內,多糖綜合得分隨超聲時間的延長而升高,當超聲時間設定為90 min時,多糖綜合得分升高至最高值，達100,說明此時廣金錢草多糖得率和多糖含量都是最高的。超聲波主要通過機械作用破壞細胞壁,促進多糖分子的溶出,而超聲時間的延長,多糖綜合得分也會升高,但時間過長,多糖分子的化學鍵積存過多的超聲能量易斷裂,導致多糖失活并析出,從而導致多糖得糖率和含糖量都有所下降,從而使綜合得分降低。因此,選擇超聲時間為90 min。

圖2 超聲時間對廣金錢草多糖綜合得分的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.3 超聲溫度對廣金錢草多糖綜合得分的影響

超聲溫度Tc對廣金錢草多糖綜合得分Z的影響如圖3所示。提取溫度設定為20 ℃時,多糖綜合得分僅為25.52。當提取溫度升高至50 ℃時,多糖的綜合得分升高至最高值，達87.44。提取溫度若繼續升高,多糖綜合得分則開始下降。多糖作為有機物質對溫度變化十分敏感。在適度范圍內,多糖分子的活性隨溫度升高而增加并加速溶出,提取率隨之上升綜合得分也上升。但是,多糖的分子結構在高溫環境中易被破壞,導致其喪失生物活性,提取率下降且綜合得分下降。因此,將提取溫度選擇為50 ℃。

圖3 超聲溫度對廣金錢草多糖綜合得分的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.4 酶解pH對廣金錢草多糖綜合得分的影響

酶解pHC對廣金錢草多糖綜合得分Z的影響如圖4所示,在一定pH范圍內,廣金錢草多糖的綜合得分隨pH增大呈先上升后降低的趨勢,pH為6時多糖的綜合得分最高值達91.62,表明酶的活性存在一個最佳的pH,越接近此值,酶的活性越高,所以選擇pH為6作為最佳酶解pH。

圖4 酶解pH值對廣金錢草多糖綜合得分的影響Fig.4 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.5 酶解溫度比對廣金錢草多糖綜合得分的影響

酶解溫度Tm對廣金錢草多糖綜合得分Z的影響如圖5所示。廣金錢草多糖綜合得分隨溫度升高有先上升后緩慢下降趨勢,當酶解溫度在60 ℃時,多糖的綜合得分升高至最高值，達99.57。這是由于酶發揮其活性需要一個最適溫度,當超過此溫度后,酶結構會慢慢變性,從而使酶解程度降低,因此選擇酶解溫度為60 ℃。

圖5 酶解溫度對廣金錢草多糖綜合得分的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.1.6 酶解時間對廣金錢草多糖綜合得分的影響

酶解時間tm對廣金錢草多糖綜合得分Z的影響如圖6所示。廣金錢草多糖的綜合得分隨酶解時間延長而呈上升后下降的趨勢,當酶解時間在60 min時,多糖的綜合得分升高至最高值，達90.09。酶解時間若繼續升高,多糖綜合得分則開始下降。可能是因為細胞壁被充分分解后,活性隨時間升高而增加并加速溶出,但時間過長,可能是酶對多糖分子產生了輕微的降解,導致其綜合得分降低,因此酶解時間選擇60 min。

圖6 酶解時間對廣金錢草多糖綜合得分的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on the comprehensive score of polysaccharides from Desmodium styracifolium

2.2 響應面法優化多糖提取工藝

2.2.1 Box-Behnken實驗結果

利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken法對實驗方案進行優化設計,安排并實施17個實驗點,實驗點方案及相應結果如表2所示。

表2 響應面法優化實驗方案及相應結果Table 2 Optimization test scheme and corresponding results by response surface method

基于本次實驗所得數據,以廣金錢草多糖提取效果的綜合得分Z,以自變量編碼A(液料比)、B(超聲時間)、C(酶解pH)進行回歸分析,并得到以下回歸方程:

Z=59.48+14.40A-10.87B-6.33C+7.33AB-16.78AC+3.67BC-2.62A2-7.58B2-0.65C2。

方差分析結果如表3所示。由表3可知,該試驗的模型P<0.05,表明該模型顯著,失擬相P=0.066 7>0.05,不顯著,極差R2的值為86.51%>85%,說明建立的模型能較好地預測廣金錢草多糖綜合得分,試驗結果與預測值差異較小,擬合程度較好。并且由表3中的P值可知,B、AC均為二次回歸模型的顯著性因素(P<0.01)。從F值看出,各因素對廣金錢草多糖綜合得分的影響程度依次為液料比A>超聲時間B>酶解pHC。

表3 回歸方差分析結果Table 3 Results of regression analysis of variance

2.2.2 響應曲面分析

根據回歸方程,得到各因素對綜合得分影響,做出響應曲面和等高線圖，結果如圖7～圖9所示。分別將液料比A、超聲時間B、酶解pHC其中兩個因素固定在零水平,可以得到另外兩個因素的交互作用對多糖綜合得分的影響,通過響應面更加直觀地表現出來。

圖7 液料比和超聲時間對綜合得分的高線圖和響應面圖Fig.7 Height diagram and response surface diagram of comprehensive score of liquid-to-material ratio and ultrasonic time

由圖7可知,等高線呈橢圓形,曲面彎曲程度較陡,A方向上曲線的坡度變化比B方向上曲線的坡度大,說明在液料比A和超聲時間B的交互作用中液料比對廣金錢草多圖綜合得分影響更大。

由圖8可知,等高線呈橢圓形,A方向上曲線的坡度變化比C方向上曲線的坡度大,說明在液料比A和酶解pHC的交互作用中液料比對廣金錢草多圖綜合得分影響更大。

圖8 液料比和酶解pH對綜合得分的高線圖和響應面圖Fig.8 Height diagram and response surface diagram of the comprehensive score of liquid-to-material ratio and enzymolysis pH value

由圖9可知,曲面彎曲程度較緩,說明超聲時間B和酶解pHC的交互效應對廣金錢草多糖的綜合得分影響并不明顯。

由圖7～圖9的3D響應面圖可知,液料比與超聲時間、酶解pH相比,液料比等高線密度高于其余兩個因素的等高線密度,說明液料比較超聲時間、酶解pH對廣金錢草多糖綜合得分影響更為顯著,與方差分析結果一致。

圖9 超聲時間和酶解pH對綜合得分的高線圖和響應面圖Fig.9 Height diagram and response surface diagram of the comprehensive score of ultrasound time and enzymolysis pH value

2.2.3 工藝的優化組合及驗證

通過回歸模型預測,得到超聲結合復合酶提取廣金錢草多糖的最佳工藝條件為液料比1∶50 mL/g、超聲時間85.23 min、酶解pH 5.5,在該條件下,多糖綜合得分高達95.23,為了便于實際操作,將此工藝調整為液料比1∶50 mL/g、超聲時間86.0 min、酶解pH 5.5,在此條件下進行5次平行驗證實驗,得到多糖綜合得分均值為92.09,與預測值綜合得分95.23相接近,符合度96.7%,表明該工藝穩定可靠。具體結果如表4所示。

表4 工藝優化驗證結果Table 4 Verification results of process optimization

3 討論

實驗采用復合酶協同超聲的方式,研究多種酶對廣金錢草多糖提取的綜合作用,從而不斷提高提取率。響應面優化法是一種實驗條件尋優的方法,本實驗在單因素的基礎上,利用響應面法優化廣金錢草多糖提取工藝,方差分析結果表明,影響廣金錢草多糖綜合得分的影響從大到小的順序為液料比A>超聲時間B>酶解pHC,且在交互效應對廣金錢草多糖綜合得分的影響中,料液比與超聲時間的交互效應對廣金錢草多糖綜合得分的影響最大。在1%復合酶濃度的條件下,最佳提取條件為液料比為1∶50 mL/g、超聲時間為86 min、酶解pH為5.5。廣金錢草多糖綜合得分預測值為95.23。

經過多次實驗得到的最佳優化結果,發現最佳提取條件并非是每個單因素的最佳結果,這可能是多因素綜合作用的結果,可能由于液料比、超聲時間與酶解pH并非都是成正比關系,所以綜合結果并非和理論值相符。此外,本次實驗只探究了以上3個因素與廣金錢草多糖綜合得分的變化關系,部分因素如超聲溫度、酶解時間或酶解溫度也會影響實驗結果。本實驗以多糖得率和多糖含量結合為綜合得分,結果還發現多糖得率和多糖含量并非成正比,可能與多糖的結構以及類型有關。未來還可從廣金錢草多糖的構型及構效來研究廣金錢草多糖的藥效機制,為廣金錢草的臨床應用研究提供參考依據。