超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜法同時檢驗全血中5種4-取代卡西酮類結構類似物

徐 琳, 倪春芳, 何洪源*, 趙海波, 劉 靜, 顧海碩

(1.中國人民公安大學偵查學院, 北京 100038; 2.上海市公安局物證鑒定中心, 上海 200083; 3.中國人民公安大學信息網絡安全學院, 北京 100038)

卡西酮是從阿拉伯茶中分離出來的天然生物堿,其結構及藥理作用與苯丙胺類興奮劑類似,是一種中樞神經系統興奮劑,食用后短時間內產生興奮作用,早期常用作抗抑郁藥物,用于醫藥衛生領域[1]。卡西酮類物質的母體為卡西酮[2],通過在芳環的取代基、α碳和氨基等位置上進行修飾[3],可合成出數百種化合物[1],因此存在許多結構類似物。隨著藥物的替代品越來越多進入毒品市場,此類物質目前已成為近年來濫用最廣泛的新型毒品之一[4],為逃避監管和打擊,不法分子通過不斷變化其化學結構在網上出售,目前中外已有多起此類中毒致死案例發生。

全血樣品是常見毒品分析的重要基質,中外檢驗全血中卡西酮類物質的最新研究方法主要有液相色譜串聯質譜法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS)[5-6]、氣相色譜串聯質譜法(gas chromatography tandem mass spectrometry,GC-MS)[7]、超高效超臨界色譜-單四極桿質譜法(ultra efficient supercritical gas chromatography single quadrupole mass spectrometry,UPSFC-QDa)[8]、氣相色譜-真空紫外檢測法(gas chromatography-vacuum ultraviolet,GC-VUV)[9]、拉曼光譜法(Raman)[10]和氣相色譜-紅外光譜法(gas chromatography-infrard spectrum,GC-IR)[11]等。對于同位置不同取代基團的卡西酮類物質在化學結構和物理化學特征性質上極為相似,如何對這些結構類似物進行準確分析,是法庭科學研究的熱點和難點問題,雖然超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)技術分辨率高、鑒別能力強、分析速度快,非常適用于檢測多種卡西酮類結構類似物,但是目前中外尚未見相關報道。因此,選取4-甲基甲卡西酮(4-methylmethcathinone,4-MMC)、4-氟甲卡西酮[1-(4-fluorophenyl)-2-methylami-nopropan-1-one,4-FMC]、4-氯甲卡西酮[1-(4-chlorophenyl)-2-(methylamino)propan-1-one,4-CMC]、4-溴甲卡西酮[1-(4-bromophenyl)-2-me-thylaminopropan-1-one,4-BMC]、4-甲氧基甲卡西酮[1-(4-methoxyphenyl)-2-methylaminopr-opan-1-one,Methedrone]5種同位置不同取代基團的毒品,建立UPLC-QTOF-MS分析全血中5種卡西酮類結構類似物的方法,對新型毒品的法庭鑒定提供可靠依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Vion IMS QTof型超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜系統(美國 Waters 公司)； Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Vortex-genie2型渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司)；Millipore TANKPE030 超純水處理系統(美國 Millipore 公司)。4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone標準品(上海市公安局)；空白全血(上海市公安局)；甲醇、乙腈(色譜純),甲酸、乙酸銨(分析純)。5種毒品化學結構式如圖1所示。

分別準確稱取10.0 mg的4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone標準品,采用甲醇溶解定容至10.0 mL,充分振蕩搖勻后,分別配制成1.00 mg/mL的標準儲備液。

取1.00 mg/mL 4-MMC、1.00 mg/mL 4-FMC、1.00 mg/mL 4-CMC、1.00 mg/mL 4-BMC、Methedrone各200 μL配成100 μg/mL混標標準儲備液,放入4 ℃冰箱中,根據所需取甲醇稀釋。

1.2 樣品前處理

室溫下,取0.5 mL全血,加入0.2 mL純水,加入10 μL不同濃度混標標準儲備液,再加入1.3 mL乙腈，震蕩1 min,使得毒品與全血完全混合,在5 ℃下12 000 r/min離心7 min。離心結束之后,取上清液待用。

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流動相A1為純水和0.1%甲酸,流動相B1為乙腈和0.1%甲酸,流動相A2為純水,流動相B2為乙腈；流速為0.4 mL/min；進樣量為1 μL；柱溫40 ℃。流動相的梯度洗脫程序如表1所示。

表1 5種毒品的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure for five drugs

1.3.2 質譜條件

毛細管電壓:0.5 kV；錐孔氣流量:50 L/h；錐孔電壓:40 V；源溫度:120 ℃；柱溫:40 ℃；樣品溫度:20 ℃；脫溶劑氣溫度:550 ℃；脫溶劑氣體流速:800 L/h；電噴霧電離(ESI),正離子掃描,多反映檢測模式(MRM)。質譜參數如表2所示。

表2 5種毒品的質譜參數Table 2 Mass spectrometry parameters of five drugs

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

實驗對比了流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)、0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)、0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)時各組的分離結果,結果顯示,當流動相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈,各目標物分離效果和響應最好。在較低濃度下,根據3種體系的峰型和穩定性,最終選擇0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈作為流動相。5種毒品的MRM色譜圖和混標總離子譜圖分別如圖2、圖3所示。

圖2 5種毒品的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of five drugs

圖3 5種毒品的混標總離子色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of five drugs with mixed standard

2.2 質譜條件的考察

5種毒品100 ng/mL的混合標準品溶液在1.3節實驗條件下,采用質譜多反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)模式進樣分析,在正離子(ESI+)模式下,得到5種毒品的準分子離子峰,同時優化錐孔電壓。準分子離子作為母離子,進行二級質譜掃描,選擇豐度較高的2個子離子與母離子分別組成離子對,定量離子對為離子強度最大的離子對。提高了檢測的靈敏度,可準確定性。5種毒品質譜圖如圖4所示。

m/z為質子數與電荷數比圖4 5種毒品的質譜圖Fig.4 Mass spectra of five drugs

2.3 標準曲線、檢出限及定量限

取7份0.5 mL空白全血,每份加入0.2 mL純水,再分別加入10 μL不同濃度混標標準儲備液,最后加入1.3 mL乙腈,配制成2、5、10、50、100、200、500 ng/mL的混標標準溶液。每種濃度配制3組,每組進樣兩次,以不同濃度混標標準溶液峰面積平均值y對濃度x(ng/mL),以1/x為權重進行線性擬合,得到線性回歸方程、相關系數。以3倍信噪比計算4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone的檢出限(信噪比S/N≥3),以10倍信噪比計算4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone的定量限(S/N≥10)。5種毒品的線性范圍在2～500 ng/mL良好,相關系數為0.999 0～0.999 7，檢出限為0.5～1 ng/mL；定量限1～2 ng/mL，結果如表3所示。

表3 5種毒品的線性方程、檢出限和定量限Table 3 Linear equation, detection limit and limit of quantification for five drugs

2.4 基質效應

取3種來源不同的空白全血,每種取3份,按照1.2節進行樣品前處理(取0.5 mL全血,加入0.2 mL水,加入1.3 mL乙腈,振蕩離心取上清液)后,加入不同濃度的混標標準儲備液,配制成3種高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)濃度的標準溶液,測得全血進行前處理后添加的標準溶液色譜峰面積平均值(S1)。取乙腈配制成3種高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)濃度的標準溶液各3份,測得標準品溶液色譜峰面積平均值(S2),基質效應=S1/S2，結果如表4所示。

表4 5種毒品的基質效應Table 4 Matrix effect of five drugs

2.5 回收率、精密度

取3種來源不同的空白全血,每種取3份(0.5 mL),按照1.2節樣品前處理方法加入0.2 mL純水,加入10 μL不同濃度混標標準儲備液,再加入1.3 mL乙腈,配制成3種高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)濃度的標準溶液,振蕩離心取上清液,平行測3次并記錄峰面積,測得全血中添加標準溶液后進行前處理的色譜峰面積平均值為S3,回收率=S3/S1,結果如表5所示。

另取3種來源不同的空白全血,每種取3份(0.5 mL),按照1.2節樣品前處理方法加入0.2 mL純水,加入10 μL不同濃度混標標準儲備液,再加入1.3 mL乙腈,配制成3種高(200 ng/mL)、中(50 ng/mL)、低(5 ng/mL)濃度的標準溶液,振蕩離心取上清液,日內平行測定5次,日間每天測定1次,共測5 d并記錄峰面積,結果如表5所示。

表5 5種毒品的回收率、精密度Table 5 Recovery rate and precision of five drugs

2.6 案例應用

將所建立的檢驗方法用于實際案例中,取兩只雄性成年大鼠(7～8周),購自上海杰思捷實驗動物有限公司,分別編號為1、2,體重分別為155、160 g。1號大鼠為空白對照,向2號大鼠投喂摻入未知濃度混標毒品溶液的食物。兩小時后取1、2號大鼠血液,將血液進行檢驗。采用上述實驗條件和方法,可在2號大鼠血液中檢出4-MMC的濃度為4.16 ng/mL,定量離子m/z為160.112 72,保留時間為2.61 min；檢出4-FMC的濃度為4.71 ng/mL,定量離子m/z為164.087 36,保留時間為2.36 min；檢出4-CMC的濃度為4.63 ng/mL,定量離子m/z為180.058 19,保留時間為2.71 min；檢出4-BMC的濃度為3.89 ng/mL,定量離子m/z為145.089 13,保留時間為2.80 min；檢出Methedrone濃度為4.27 ng/mL,定量離子m/z為176.108 19,保留時間為2.46 min。色譜圖如圖5所示。1號大鼠血液中未檢驗出毒品。由此表明本實驗建立的方法可實現對全血檢材中的卡西酮類結構類似物進行檢驗。

圖5 2號大鼠檢出毒品的色譜圖Fig.5 Chromatogram of drug detection in rat 2

3 結論

建立了全血中4-MMC、4-FMC、4-CMC、4-BMC、Methedrone 5種4-取代卡西酮類結構類似物的UPLC-QTOF-MS檢驗方法,本文方法快速準確、回收率高,適用于區分全血中多種同位置不同取代基團的卡西酮類結構類似物的定性、定量分析,對于該類新型毒品的檢測工作具有實際意義。