基于網絡藥理學與分子對接技術的清瘟護肺顆粒防治新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的潛在藥效物質研究

劉琪琪，李 純，周 潔，孫婷婷，狄志彪，李 曄,，劉 洋*，張 紅*

1陜西中醫藥大學藥學院，咸陽 712046；2陜西省中醫藥研究院，西安 710003

2019年12月以來，由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性肺炎在全世界相繼爆發，截止2020年10月22日，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)累計確診人數達1 288萬余人，死亡率在某些國家已超過10%，目前尚未發現特效藥[1]。中醫藥抗擊瘟疫已有千年的歷史，并在抗擊COVID-19中取得了矚目的療效，COVID-19初起表現為發熱、干咳、乏力，與溫病上焦衛氣同病證相似；出現昏迷、甚至死亡與“逆傳心包證”相吻合；恢復期乏力的表現與肺胃陰傷的溫病學證候特點相似[2]，據患者不同體質對癥下藥，標本兼治，可以有效改善患者的癥狀。國家衛健委及國家中醫藥管理局頒發的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中推薦不同的復方和中成藥對癥治療[3]。從療效、安全性、經濟性等方面分析，中醫藥在防治COVID-19 都具有很大的優勢。因此研究防治新冠肺炎的中藥復方及其作用機理，具有重要意義。

清瘟護肺顆粒是陜西省中醫藥研究院針對本次新冠疫情研發的防治COVID-19的院內制劑，已通過了省藥品監督管理局的審批(陜藥監函[2020]60號)，于2月17日生產上市，銷量良好[4]。該復方是在銀翹散、玄麥甘桔湯和四君子湯基礎上進行加減而成，由金銀花、連翹、大青葉、玄參、杏仁、浙貝母、桔梗、蘇葉、防風、炒白術、茯苓、茵陳、黨參、竹葉、麥冬、生甘草十六味藥組成[5]。清瘟護肺顆粒具有疏風解熱，清肺止咳的功效，主治瘟病初起，見有發熱、干咳、咽痛、食少等癥狀，適用于新型冠狀病毒感染疑似及新型冠狀病毒感染的輕癥。現代藥理學研究表明本方中多味中藥可通過抑制機體固有免疫的激活，抗炎解熱，減輕肺臟等組織損傷[6]。

2007年，英國藥理學家Hopkins在Nature Biotechnology雜志中首次提出“網絡藥理學(network pharmacology)”的概念，其對藥物-藥物、藥物-疾病網絡進行了分析，闡釋了中藥治療疾病的機理，不再局限于單個成分、單個靶標、單一疾病的研究思想，為中醫藥的研究與發展提供了新的思路[7]。基于幾何匹配和能量匹配的“鎖-鑰原理”的分子對接技術，可用來分析蛋白質-配體識別，已經成為中醫藥現代化研究的有力工具。分子對接的可靠性取決于所采用的評分函數的準確性，計分功能可用于確定配體的結合模式和位點，預測結合親和力，并識別給定蛋白靶標的潛在藥物先導[8]。研究已證實COVID-19病毒有效靶點SARS-CoV-2 3CL水解酶在病毒多蛋白的蛋白水解過程中起關鍵作用，是病毒復制和功能所必需的蛋白，被認為是關鍵的藥物靶點。血管緊張素轉化酶II(ACE2)在介導SARS-CoV-2入侵細胞、促進病毒復制、加重急性肺損傷方面發揮重要作用，也是潛在的藥物篩選靶點可以作為一種新型的生物療法來攔截病毒，可抑制感染的進展，減輕肺損傷。RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)是病毒RNA復制的關鍵酶，可抑制病毒RNA的復制[9]。本研究基于網絡藥理學方法和分子對接技術探討清瘟護肺顆粒藥效成分、作用靶點及信號通路，為深入研究其防治COVID-19的藥效物質基礎提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥化學成分和疾病相關靶點篩選

利用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://lsp.Nwu.edu.cn /tcmsp.Php)、BATMAN-TCM(A Bioinformatics Analysis Tool for Molecular MechANis of Traditional Chinese Medicine，http://bionet.ncpsb.org/)及中醫藥整合藥理學研究平臺(TCMIP，http://www.tcmip.cn/)數據庫篩選清瘟護肺顆粒中十六味中藥材的活性成分及相關靶點。利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org)將所有蛋白的名稱進行標準化，得到靶標蛋白所對應的基因名稱。

1.2 疾病靶點篩選

利用GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org/)數據庫分別以“novel coronavirus”、“Coronavirus 2019 ”、“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞檢索疾病相關靶點。

1.3 靶點映射與靶蛋白互作分析

本實驗將藥物靶點與疾病靶點上傳至venny2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖，得到藥材活性成分相關靶點與疾病靶點的交集靶點。將清瘟護肺顆粒防治COVID-19的交集靶點導入String數據庫(https://string-db.org /)進行分析，并利用Cytoscape3.7.1軟件構建蛋白互作網絡圖(protein protein interaction network，PPI)。利用軟件中“Network Analyzer”功能，并根據拓撲學參數中的degree值和score值設置節點大小及顏色反應。其中degree值是網絡分析中刻畫節點中心性的最直接度量指標。節點degree值越大，該節點越重要。Score值反映了該節點及周邊節點的密集程度，節點score值越大，該節點連接的節點數越多。

1.4 GO富集分析及KEGG通路富集分析

利用R3.6.0軟件對藥材與疾病的交集靶點進行GO(Gene Ontology)生物信息學富集，分別從基因靶點的分子功能(molecular function，MF)、所處的細胞位置(cellular component，CC)和參與的生物過程(biological process，BP)三個方面分析，P值設為P≤ 0.05，利用Origin軟件作條形圖可視化分析。利用R語言中Cluster profiler數據包對藥材與疾病的交集靶點進行KEGG通路富集分析。通過查閱文獻及degree排名，篩選20條相關KEGG通路，采用ggplot2數據包對KEGG通路富集結果進行可視化分析。

1.5 網絡構建與分析

利用Cytoscape3.7.1軟件，將清瘟護肺顆粒藥材、活性成分及疾病交集靶點導入軟件進行可視化分析，利用Cytoscape3.7.1軟件中的Merge功能，構建藥材-成分-靶點(herb-compounds-target)網絡關系圖，根據網絡拓撲學參數中的緊密中心性(closeness centrality，CC)、介數中心性(betweenness centrality，BC)和度值(degree)進行分析。根據KEGG富集結果篩選出的20條通路，利用Cytoscape3.7.1軟件中的Merge功能構建靶點-通路(target-pathway)，根據網絡中的拓撲學參數BC、CC、Degree進行分析，得出清瘟護肺顆粒防治COVID-19的主要活性成分和重要靶點。

1.6 分子對接

利用RCSB PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載由上海科技大學饒子和楊海濤團隊提供的COVID-19病毒有效靶點SARS-CoV-2 3CL水解酶(SARS-CoV 3CLpro)(PDB ID：6LU7)、血管緊張素轉化酶II(ACE2) (PDB ID：1R42)和RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)(PDB ID：6L4R)的PDB格式文件用于分子對接研究，下載清瘟護肺顆粒中槲皮素、β-谷甾醇、漢黃芪素、木犀草素的mol2格式文件。利用AutoDock4.2.1軟件進行分子對接，預測配體與受體之間最佳的結合模式[10]。

2 結果與分析

2.1 清瘟護肺顆粒活性成分的篩選

本研究通過TCMSP數據庫，BATMAN-TCM數據庫及TCMIP數據庫得到清瘟護肺顆粒16味藥材的化學成分，其中金銀花63個、連翹67個、大青葉34個、玄參39個、杏仁82個、浙貝母57個、桔梗39個、蘇葉48個、防風50個、炒白術27個、茯苓48個、茵陳85個、黨參83個、竹葉7個、麥冬2個、生甘草92個合計823個化學成分，篩選重復后得到473個化學成分。其相關作用靶點共13 101個，篩選重復后得到878個靶點。

2.2 疾病靶點的篩選

通過OMIM和GeneCards數據庫分別以“novel coronavirus”、“coronavirus 2019”、“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞檢索疾病靶點，分別檢索到529、438、791個靶點，篩選重復后得到787個疾病靶點。

2.3 交集靶點收集與PPI網絡圖的構建

將藥材成分靶點與疾病靶點通過韋恩圖映射，得到123個疾病與藥材成分的交集靶點，結果見圖1。將交集靶點導入STRING數據庫，利用Cytoscape3.7.1軟件構建PPI網絡圖，如圖2所示，該網絡圖共有82個節點，241條邊，其degree 值越大，節點越大；Combine score 值越小，顏色越明亮；degree 值越小，線條越細。

圖1 成分與疾病靶點交集分布Fig.1 Distribution of Intersection Compounds and Disease Target

2.4 GO生物過程和KEGG通路富集分析

本研究為更好闡明清瘟護肺顆粒防治COVID-19的作用機制，將藥材與疾病的交集靶點導入R3.6.0軟件中，對靶蛋白進行GO生物學功能分析，P≤0.05，利用origin軟件可視化分析，結果見圖3。GO分為分子功能MF、BP和CC三個部分。其中橫坐標表示富集靶點的數目，縱坐標代表GO富集分析的過程。利用R語言對靶蛋白進行KEGG通路分析，富集到136條通路，通過查閱文獻及degree排名，篩選出20條主要相關通路，包括MAPK、PI3K/AKT、IL-17、HIF-1等信號通路。采用ggplot2數據包對KEGG通路富集結果進行可視化分析，連接度越高，圓圈越大，P值越高，顏色越偏向紅色，結果見圖4。

圖3 清瘟護肺顆粒防治COVID-19的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of Qingwen Hufei granules in the treatment of COVID-19

2.5 藥材-成分-靶點網絡構建分析

將藥材、藥材活性成分、交集靶點與疾病生成關聯表，導入Cytoscape3.7.1軟件構建清瘟護肺顆粒的“藥材-成分-靶點”關聯網絡，結果見圖5。構建的關聯網絡包括251個節點和1143個邊。根據拓撲學參數分析，得出同時滿足大于BC、CC、degree三個均值篩選得到槲皮素、漢黃芪素等15個藥效成分，結果見表1。

圖5 清瘟護肺顆粒防治COVID-19藥材-成分-靶點網絡圖Fig.5 Herb-compound-targe tnetwork of Qingwen Hufei granules in the treatment of COVID-19注：綠色橢圓：中藥材；藍色方塊：活性成分；黃色菱形：靶點。Note:Green ellipse:Herb;Blue diamond:Compound;Yellow rhombus:Target.

表1 清瘟護肺顆粒防治COVID-19的藥效成分

2.6 靶點-通路網絡構建分析

根據KEGG富集分析結果及查閱文獻篩選得到20條通路，導入Cytoscape3.7.1軟件構建清瘟護肺顆粒的“靶點-通路”關聯網絡，結果見圖6，圖中包括74個節點，334條邊。根據拓撲學參數分析，得出同時滿足大于BC、CC、degree三個均值的15個靶點，分別為MAPK1、MAPK3、RELA、IL6、MAPK8、BCL2、TNF、MAPK14、PRKCB、CCND1、STAT3、IL1β、CASP3、PRKCA、EGFR，結果見表2。

圖7 SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2及RdRp與藥效成分的分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram of 7SARS-CoV-23CL hydrolase,ACE2 and RdRp with active compounds注：a.ACE2-β-谷甾醇；b.ACE2-漢黃芪素；c.ACE2-木犀草素；d.ACE2-槲皮素；e.SARS-CoV-23CL水解酶-β-谷甾醇；f.SARS-CoV-23CL水解酶-漢黃芪素g.SARS-CoV-23CL水解酶-木犀草素；h.SARS-CoV-23CL水解酶-槲皮素；i.RdRp-β-谷甾醇；j.RdRp-漢黃芪素；k.RdRp-木犀草素；l.RdRp-槲皮素。Note:a.ACE2-β-sitosterol;b.ACE2-wogonin;c.ACE2-luteolin;d.ACE2-quercetin;e.SARS-CoV-2 3CL hydrolase-β-sitosterol;f.SARS-CoV-2 3CL hydrolase-wogonin;g.SARS-CoV-2 3CL hydrolase-luteolin;h.SARS-CoV-2 3CL hydrolase-quercetin;i.RdRp-β-sitosterol;j.RdRp-wogonin;k.RdRp-luteolin;l.RdRp- quercetin.

2.7 潛在藥效成分與ACE2、SARS-CoV-23CL水解酶和RdRp的分子對接結果分析

根據拓撲學分析清瘟護肺顆粒在“藥材-成分-靶點”網絡圖得到排名較高的藥效成分，通過Autodock4.2.1軟件將藥效成分漢黃芩素、槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2進行分子對接，結果見圖7。 其中清瘟護肺顆粒中化合物漢黃芩素、槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇與SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2和RdRp均小于-5 kcal/mol，表明均有較好的親和性，結果見表3。

表3 清瘟護肺顆粒核心化合物與 SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2和RdRp的結合能力

3 討論

根據新型冠狀病毒肺炎臨床癥狀可知，病因多以濕熱濁毒為主，在我國抗疫歷史中，中醫藥起到了不可或缺的作用。中藥含多種有效成分可多靶點多環節作用，用量可隨證加減，可調節免疫力和抗病毒，毒副作用較小，作用平和。清瘟護肺顆粒是由金銀花、連翹、大青葉、玄參、杏仁、浙貝母、桔梗、蘇葉、防風、炒白術、茯苓、茵陳、黨參、竹葉、麥冬、生甘草十六味藥組成。方中金銀花、連翹、浙貝母清熱解毒，清肺止渴為君藥；大青葉、竹葉、桔梗具有清熱解毒，疏風透邪的功效；黨參、炒白術、茯苓固護后天之本；浙貝母、桔梗、紫蘇葉及苦杏仁配伍可清熱宣肺，黨參與黃芪配伍可補益肺氣，生津止渴，可治療脾肺氣虛，清熱消渴[11,12]。

本研究通過拓撲學分析得到“藥材-成分-靶點”網絡圖中清瘟護肺顆粒防治COVID-19的15個主要藥效成分。研究表明，甘草酚、大黃豆素具有抑制病毒的作用[13,14]。芒柄花黃素可通過調節COX-2/PGE?的表達抑制腸道病毒的復制[15]。查閱文獻得出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)可引起的金黃色葡萄球菌肺炎，其中α毒素是一種必不可少的毒力因子，而柚皮素可顯著抑制α毒素的表達從而減輕感染小鼠的肺損傷和炎癥癥狀[16]。槲皮素具有抗菌、抗病毒、免疫調節的藥理作用，其可有效減少肺炎組織炎癥細胞浸潤，抑制上皮細胞增生，有效改善肺炎小鼠肺組織病理學損傷，同時可減少病毒的復制，可有效預防和治療病毒[17,18]。因此，清瘟護肺顆粒中的主要藥效成分具有抑制病毒的作用。

本研究通過拓撲學分析得到“靶點-通路”網絡圖中清瘟護肺顆粒防治COVID-19的15個重要靶點。其中，RELA是一種抗病毒轉錄因子，Bais等人闡明了依賴RELA的生存因子，抑制了感染引起的細胞死亡，阻止了RERA缺陷細胞中Chandipura病毒(CHPV)的增殖[19]。在甲型流感病毒(IAV)感染過程中，IAV感染刺激了可溶性IL-6受體(sIL-6R)的表達，sIL-6R是一種參與IL-6信號轉導的多功能蛋白，且sIL-6R的表達上調了其自身配體IL-6和促炎細胞因子IL-32的水平，認為IL-6是參與病毒感染急性炎癥反應的關鍵細胞因子[20]。其中TNF-α和IL-1β是炎癥因子，具有較強的致炎活性，可誘導血管內皮細胞通透性增加，促進炎癥反應[21]。清瘟護肺顆粒可通過改善機體炎癥反應，達到促炎因子與抗炎因子動態平衡。綜上可得，篩選的重要靶點與COVID-19有密切關系，其可能為該制劑的有效作用靶點。

通過KEGG富集及文獻研究篩選的20條通路，其中IL-17 信號通路與多種炎癥肺病疾病有關，IL-17上調可導致肺損傷加重，IL-17抑制劑可顯著減輕肺部炎癥，并抑制NF-κB的表達和激活，降低促炎癥因子的水平，可誘導VEGF表達上調，顯著抑制肺組織和細胞的炎性細胞因子水平[22]。通過獲得性肺炎(CAP)患兒支氣T管肺泡灌洗液(BAL)的檢測，發現重度CAP患兒的IL-17水平明顯增高。Th17細胞在肺部炎癥和纖維化中起關鍵作用，Th17細胞和IL-17A信號在宿主防御和疾病發展中的意義已在各種感染和自身免疫模型中得到證實[23]。大量研究表明，Th17細胞及其標志性細胞因子IL-17A在呼吸道抵抗各種細菌和真菌感染的免疫反應中起關鍵作用。IL-17A可作用于感染組織中的非免疫細胞，通過誘導抗菌蛋白、細胞因子和趨化因子的表達來增強先天免疫。Yang等[24]研究表明，抑制PI3K/AKT信號通路Beclin1過表達可阻斷肺炎甲型流感病毒感染后肺炎鏈球菌的再感染。因此，清瘟護肺顆粒可能通過以上通路防治COVID-19。

分子對接結果表明，清瘟護肺顆粒中的藥效成分木犀草素、槲皮素、漢黃芩素、β-谷甾醇與SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2和RdRp的結合能均小于<-5 kcal/mol，推測清瘟護肺顆粒的藥效成分可能通過阻止病毒進入宿主細胞與ACE2結合，阻斷SARS-CoV-2病毒蛋白與SARS-CoV-2 3CL水解酶結合，阻斷病毒RNA復制過程，從而發揮防治效果。

綜上所述，本文運用網絡藥理學方法分析清瘟護肺顆粒防治新型冠狀肺炎的潛在藥效物質，分析篩選清瘟護肺顆粒防治COVID-19的15個藥效成分以及15個重要靶點。基于KEGG富集和文獻報道分析得到清瘟護肺顆粒防治COVID-19的20條相關信號通路；清瘟護肺顆粒的藥效成分木犀草素、槲皮素、漢黃芩素等可能通過與SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2和RdRp結合作用于MAPK1、MAPK3、RELA、IL6等15個重要靶點調控IL-17 信號通路、PI3K/AKT信號通路等多條信號通路，達到防治 COVID-19的作用。該研究為進一步研究清瘟護肺顆粒防治COVID-19的藥效成分及作用機制提供了參考。