基于對NOD小鼠頜下腺RORγt、Foxp3及其mRNA調節探討白芍總苷治療干燥綜合征的作用機制

吳國琳，王 慶，盧雯雯，熊福林，高 麗，卞 華*

1浙江大學醫學院附屬第一醫院，杭州 310003；2浙江省立同德醫院，杭州 310012；3南陽理工學院 河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室，南陽 473004

干燥綜合征(sjogren’s syndrome，SS)是一種常見的風濕免疫性疾病，多發生于中青年女性，其發病率列風濕免疫性疾病第二位。常見臨床癥狀為口干、眼干、關節疼痛、乏力等，嚴重者可影響生活質量。目前SS尚無確切的病因和發病機制，一般認為是在遺傳、病毒感染和性激素異常等多種因素作用下，導致機體免疫功能異常，通過多種細胞因子和炎癥介質造成淋巴細胞侵犯唾液腺和淚腺等外分泌腺而發病[1]。有研究證實T輔助細胞17(Thl7)/Treg細胞偏移及其免疫失衡與SS發病密切相關，而Th17/Treg之間的動態平衡可通過其相應的轉錄因子維甲酸相關孤獨受體γt(retinoidrelated orphan receptor，RORγt)/叉狀頭轉錄因子3(forkhead transcription factor 3，Foxp3)介導[2]。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從中藥白芍中提取的一種糖苷類物質，是白芍的主要化學成分[3]，在臨床應用治療SS能改善患者口干、眼干等癥狀，有較好臨床療效，且安全性較高[4]。本實驗旨在通過研究白芍總苷對SS模型小鼠頜下腺Th17、Treg細胞的特異性轉錄因子ROR γt mRNA、FoxP3 mRNA的表達水平的影響，探討白芍總苷治療SS的可能作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇8周齡的雌性非肥胖型糖尿病(non obese diabetes，NOD)小鼠24只，SPF級，購自上海斯萊克動物實驗中心，合格證號：20130016000707。在無菌的恒定溫度和濕度條件下飼養。實驗方案經浙江大學醫學院附屬第一醫院實驗動物倫理委員會審批通過(批件號(2018)實動快審第(048)號)。

1.2 實驗藥物

白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司生產，規格0.3 g/粒，批號20180718)用蒸餾水稀釋成含生藥量15 g/mL。硫酸羥氯喹片(由上海中西制藥有限公司生產，規格：0.1 g/片，批號：180812)，用蒸餾水稀釋成含生藥量3 mg/mL。

1.3 實驗試劑

實驗用反轉錄試劑盒(TAKARA公司)；兔抗鼠RORγt、FoxP3多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司生產)；RORγt、FoxP3原位雜交檢測試劑盒(武漢博士德公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及給藥

將24只NOD小鼠隨機分為4組，即模型組、白芍總苷組、羥氯喹組以及聯合組，每組各6只，另外選6只BALB/c小鼠為正常對照組。每組小鼠的給藥量按動物與人等效劑量換算表計算。

白芍總苷組每日定時按照300 mg/kg劑量分別灌胃TGP稀釋液0.4 mL，羥氯喹組每日按60 mg/kg劑量灌胃硫酸羥氯喹稀釋液0.4 mL,聯合組每日灌胃TGP 0.4 mL+羥氯喹0.4 mL。模型組和正常組灌胃等體積的生理鹽水0.4 mL。

2.2 指標檢測

各組小鼠在喂養并給藥8周后，頸椎脫臼處死后，立即摘取雙側頜下腺組織進行指標檢測。觀察及檢測指標如下。

2.2.1 頜下腺組織病理觀察

將摘取的小鼠頜下腺組織放置于4%多聚甲醛中固定，然后包埋、切片、HE染色后，在光鏡下觀察組織的病理變化，分析各組小鼠頜下腺的淋巴細胞浸潤程度，并根據Chisholm- Mason組織學評分方法將各組小鼠頜下腺病變輕重程度進行量化分析，評價標準見表1。

2.2.2 RT-PCR法檢測頜下腺組織RORγt mRNA、FoxP3 mRNA的表達

2.2.2.1 檢測步驟

以GAPDH為內參，用Trisol試劑盒提取頜下腺總RNA，然后取1 μL進行RT-PCR分析。GAPDH引物序列：上游5′-AAGGGTGGAGCCAAAAGGG-3，下游5′-TGGGGGTAGGA ACACGGAA-3；RORγt引物序列：上游5′-AAGCAGGAGCAATGGAAGTCG-3，下游5′- GAGAACCAGGGCCGTGTAGAG-3；FoxP3引物序列為：5′-GAGAAAGCGGATACCA AATGA -3，下游5′-GAGACAGAGATGGGCAAGAAG-3。本實驗PCR反應參數為94 ℃ 5 min，再將反應條件變為94 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，然后循環擴增40次，于60 ℃檢測熒光值。RORγt mRNA、FoxP3 mRNA及內參GAPDH分別在兩個管中同時進行PCR反應，除探針和引物外，兩管中加入的RNA模板和其他反應試劑均一致。

表1 SS模型小鼠頜下腺病理學評價標準

2.2.2.2 結果判斷

通過ABI Stepone plus熒光定量PCR儀測定并取其循環閾值均值(CT值)，結果采用相對定量分析法，即2-△△CT法進行mRNA相對表達量的計算，以各組△CT值進行統計學分析，本實驗以模型組做為未處理組，與其他各組進行比較。具體計算公式如下：

△CT=目的基因CT值(實驗組)-該組內參基因CT值

△△CT=(目的基因CT值—內參基因CT值)實驗組-(目的基因CT值—內參基因CT值)模型組

△CT值越小表示RORγt mRNA、FoxP3 mRNA在頜下腺組織中的表達越高，而2-△△CT值越高，表明樣本中RORγt mRNA、FoxP3 mRNA相對于模型組表達量越大。

2.3 統計學處理

3 結果

實驗過程中，模型組和羥氯喹組各有1只小鼠死亡，經解剖后發現是因灌胃不當損傷食管引起。

3.1 各組小鼠頜下腺組織形態學觀察

3.1.1 光鏡下頜下腺病理觀察

頜下腺病理觀察顯示(見圖1)，正常組頜下腺腺泡大小基本均一，腺泡及導管結構正常，間質中未見淋巴細胞浸潤。模型組頜下腺腺泡大小不等，部分有破壞，間質有中度或重度淋巴細胞浸潤，可見局部腺體萎縮及纖維組織增生。白芍總苷組、羥氯喹組以及聯合組小鼠頜下腺病理顯示腺泡大小不一，可見少量腺泡和導管結構破壞，有散在的單個淋巴細胞浸潤，且聯合組少于白芍總苷組和羥氯喹組。

圖1 各組小鼠頜下腺病理(HE 10×40)Fig.1 Submandibular gland pathology of mice in each group(HE 10×40)注：A：正常組；B：模型組；C：羥氯喹組；D：白芍總苷組；E：聯合組。Note:A:The normal group;B:Model group;C:HCQ group;D:TGP group;E:Combined group.

3.1.2 各組小鼠頜下腺組織病理評分比較

表2 各組頜下腺組織病理評分比較

病理評分顯示(見表2)，正常組小鼠頜下腺組織病理評分顯著低于其他實驗組(P<0.05)，模型組小鼠頜下腺組織病理評分明顯高于其他組，統計有顯著性差異(P<0.05)。聯合組低于白芍總苷組和羥氯喹組，統計具有顯著性差異(P<0.05)。

3.2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的表達比較

3.2.1 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量△CT比較

由表3中可以看出，正常組小鼠頜下腺組織RORγt mRNA的△CT值顯著低于其他實驗組，模型組高于其他各組，且與正常組和聯合組相比有顯著統計學差異(P<0.05)，而聯合組低于模型組、羥氯喹組和白芍總苷組，統計有顯著性差異(P<0.05)。

表3 各組頜下腺RORγt mRNA、Foxp 3 mRNA表達量△CT比較

各組小鼠頜下腺組織Foxp3 mRNA的△CT值比較發現，模型組明顯低于其他組，且與正常組和聯合組相比統計具有顯著性差異(P<0.05)，聯合組雖然高于羥氯喹組和白芍總苷組，但無統計學意義(P>0.05)。

3.2.2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量2-△△CT值比較

從圖2中看出，各組小鼠頜下腺組織RORγt mRNA表達量的2-△△CT值從高到低一次為：模型組>羥氯喹組>白芍總苷組>聯合組>正常組；各組小鼠頜下腺組織FoxP3 mRNA表達量的2-△△CT值從高到低依次為：正常組>聯合組>白芍總苷組>羥氯喹組>模型組。

4 討論

SS的病因和發病機制雖然不明，但與機體自身免疫耐受被打破導致免疫穩態失衡有重要關系。近年來，輔助性T細胞(Th)的分化及其免疫平衡在SS發病中的作用逐漸受到關注，一般認為，Th17/Treg之間的動態平衡對維持免疫內環境的穩定具有重要作用，若此種平衡失調可引起全身或局部免疫應答異常，導致自身免疫性疾病的發生發展[2]。輔助性T細胞的分化方向取決于調控其分化的關鍵轉錄因子。研究證實，RORγt的表達激活促進前體細胞分化為Thl7細胞，是Th17細胞的特異性轉錄因子，維持Thl7細胞的分泌功能，對致病性Thl7細胞的分化起關鍵性作用。而Foxp3是控制Treg細胞分化的關鍵轉錄因子，研究發現pSS患者唇腺中Foxp3 mRNA表達降低，Foxp3參與了pSS的發病[5]。在SS的發病過程中，Thl7效應增強可能促進SS的發展及惡化，而調節性Treg細胞可抑制過度亢進的Thl7，以維持機體免疫耐受和免疫穩態，但Thl7/Treg免疫失衡可能促發或加劇SS的發生發展[6]，提示轉錄因子RORγt/FoxP3介導Thl7/ Treg之間的免疫平衡與SS發病密切相關。

圖2 各組小鼠頜下腺RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達量2-△△CT值Fig.2 Relative expression levels of RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in submandibular glands of mice in each group 2-△△CT values

目前SS無有效治療方法，治療目標是緩解癥狀和預防并發癥。而中西藥協同治療SS可有助于緩解SS患者口干、眼干、乏力、關節痛等癥狀，促進淚腺和唾液分泌功能，提高患者生活質量，避免西藥不良反應，減少復發率，其優勢已被廣泛認可[7]。TGP治療SS有明顯的臨床療效，TGP聯合HCQ治療pSS效果顯著，且副作用較少[8]。

NOD小鼠是目前最為理想的干燥綜合征實驗動物模型,廣泛應用于SS的發病機制及療效研究[9]。現代藥理研究表明，白芍總苷能減輕NOD小鼠頜下腺淋巴細胞灶性浸潤程度，可預防自發性涎腺炎的發生[10]，也能促進NOD小鼠頜下腺水分子通道蛋白-5(AQP-5)的表達，改善口干多飲等癥狀，并能調節小鼠血清及頜下腺組織的Thl/Th2型細胞因子表達[11,12]。

本實驗研究發現，模型組NOD小鼠頜下腺病理損害明顯較正常組嚴重，經藥物干預后均得到不同程度的改善，且聯合組明顯優于單純羥氯喹組和白芍總苷組。同時發現，模型組NOD小鼠頜下腺RORγt mRNA的表達明顯高于正常組，而Foxp3 mRNA的表達明顯低于正常組，經藥物干預后發現，聯合組能明顯降低頜下腺RORγt mRNA的表達，最接近于正常組，效果優于羥氯喹組和白芍總苷組。聯合組頜下腺Foxp3 mRNA的表達低于模型組、羥氯喹組和白芍總苷組，且與模型組相比有顯著性差異。實驗結果表明，白芍總苷能改善干燥綜合征NOD小鼠頜下腺的病理損害，并能有效下調RORγt mRNA的表達，上調Foxp3 mRNA的表達，由此我們推測，白芍總苷可能通過調節調控轉錄因子RORγtmRNA、FoxP3mRNA的表達，從而調節其相應介導的Thl7/Treg之間的免疫平衡而起到治療SS的作用，將為今后進一步深入研究白芍總苷的免疫調節機制提供新思路。