當(dāng)歸芍藥散對新型冠狀病毒肺炎的臨床療效及其作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

劉宇寒，潘廣濤，尚羅銳，周方園，楊勝蘭

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430000

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種由新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒(SARS-Cov-2)引起的急性傳染病。該疾病具有傳染性強(qiáng)，潛伏期長、始發(fā)癥狀多樣化等特點(diǎn)，臨床癥狀早期可表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、乏力、納差、腹瀉等，隨病情進(jìn)展可出現(xiàn)呼吸困難、胸悶胸痛等癥，危重者可進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、多器官功能衰竭、凝血功能障礙等[1]。截止2020年3月25日24時，我國累計報告確診病例81 285例，累計死亡病例3 287例[2]。目前尚無治療新型冠狀病毒肺炎的特效藥物，但中醫(yī)藥具有整體觀念、辨證論治的優(yōu)勢，可對不同患者制定個體化的中醫(yī)治療方案，在臨床治療中取得顯著療效。

當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，由當(dāng)歸、芍藥、川芎、白術(shù)、澤瀉、茯苓六味中藥組成，具有養(yǎng)血調(diào)肝，健脾利濕的功效。武漢協(xié)和醫(yī)院是新冠肺炎重癥患者救治定點(diǎn)醫(yī)院，本研究團(tuán)隊在三因制宜原則及運(yùn)氣學(xué)說指導(dǎo)下，應(yīng)用當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19重癥患者100例，取得滿意療效。

為進(jìn)一步闡明當(dāng)歸芍藥散對COVID-19的作用機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，篩選當(dāng)歸芍藥散的活性活性成分，運(yùn)用TCMSP、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索當(dāng)歸芍藥散及COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”的互作網(wǎng)絡(luò)，并對其交集靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采取回顧性分析方法，使用隨機(jī)數(shù)表法選取2020年1月20日到2020年3月20日在武漢協(xié)和醫(yī)院住院的100名COVID-19患者作為研究對象。其中男41例(41%)，女59例(59%)，年齡28～49歲，平均63.75±13.23歲；平均體溫38.30±0.62 ℃；心率91.51±16.73次/min；呼吸20.6±2.47次/min；氧飽和度92.9%±5.84%；既往病史中高血壓48例(48%)，糖尿病34例(34%)，冠心病29例(29%)，慢性肝病10例(10%)。

1.2 治療方案

新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案中基礎(chǔ)治療方案結(jié)合當(dāng)歸芍藥散，每日一劑，水煎400 mL分兩到四次溫服。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察治療前及治療后10天體溫、心率、呼吸、氧飽和度的改善情況、主要癥狀的消失情況、核酸轉(zhuǎn)陰率、CT影像學(xué)好轉(zhuǎn)率、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括白細(xì)胞(WBC)計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)(LYMPH)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)的變化水平。

1.4 統(tǒng)計方法

1.5 當(dāng)歸芍藥散中活性成分及其作用靶點(diǎn)信息的收集

將當(dāng)歸芍藥散中涉及的中藥(當(dāng)歸、芍藥、川芎、白術(shù)、澤瀉、茯苓)，其中芍藥根據(jù)原方義確定為白芍，分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺[3](TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)進(jìn)行檢索，得到所有中藥活性成分及其作用靶點(diǎn)，按口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30%及類藥性(drug-like，DL)>0.18 進(jìn)行篩選。利用Universal Protein數(shù)據(jù)庫[4](UniProt，https://www.uniprot.org/)檢索各靶點(diǎn)對應(yīng)的基因名稱，利用Perl語言進(jìn)行名稱轉(zhuǎn)換，得到藥物靶點(diǎn)基因列表，以便后續(xù)分析。

1.6 COVID-19疾病靶點(diǎn)的獲取及當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫[5](https://www.genecards.org/)，輸入疾病名稱“novel coronavirus pneumonia”，獲得該疾病對應(yīng)靶點(diǎn)信息。利用Draw Venn Diagram網(wǎng)站對疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)分析，提取二者交集，為當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的潛在作用靶點(diǎn)。

1.7 當(dāng)歸芍藥散活性成分-COVID-19-疾病靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用STRING網(wǎng)站[6](https://string-db.org/)，設(shè)定物種來源為“Homo sapiens”，輸入之前分析得到的藥物-疾病靶點(diǎn)交集，分析得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape3.6.1[7]對共同靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計，并對結(jié)果進(jìn)行可視化展示，對該網(wǎng)絡(luò)圖而言，顏色越深，節(jié)點(diǎn)越大，節(jié)點(diǎn)自由度越高，重要性越強(qiáng)。

1.8 當(dāng)歸芍藥散活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將之前得到的藥物及疾病對應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)，藥物的活性成分信息，分別導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，繪制“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，

1.9 當(dāng)歸芍藥散活性成分-疾病靶點(diǎn)的GO功能富集分析

運(yùn)用R語言及其后臺數(shù)據(jù)庫“org.Hs.eg.db”獲取此前得到的藥物相關(guān)疾病的潛在作用靶點(diǎn)的基因ID(entrezID)，再運(yùn)用DAVID[8](https://david.ncifcrf.gov/)對潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能富集分析，包括以下三方面內(nèi)容：生物學(xué)過程富集分析(biological process，BP)、細(xì)胞組成富集分析(cellular component，CC)、分子功能富集分析(molecular function，MF)，利用R語言對其進(jìn)行可視化處理，設(shè)定pvalueCutoff = 0.05，qvalueCutoff = 0.05，按顯著性排序，將GO三部分各自前10條富集條目以柱狀圖展示。

1.10 當(dāng)歸芍藥散活性成分-疾病靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

獲取基因ID步驟同GO分析，運(yùn)用R語言clusterProfiler程序包對得到的進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，設(shè)定pvalueCutoff = 0.05，qvalueCutoff = 0.05，按顯著性排序，將排名前20的富集條目以氣泡圖展示。

2 結(jié)果

2.1 COVID-19患者基本體征及主要癥狀改善情況

治療后10天，COVID-19患者基本體征包括體溫、心率較治療前明顯下降(P<0.05)，氧飽和度較前明顯上升(P<0.01)；且具有相關(guān)癥狀包括發(fā)熱、咳嗽咳痰、咽干咽痛、乏力、胸悶氣促的患者人數(shù)較治療前明顯減少(P<0.01)(見表1～2)。

表1 COVID-19患者基本體征改善情況

表2 COVID-19患者主要癥狀改善情況

2.2 COVID-19患者實(shí)驗(yàn)室檢查及核酸、CT影像學(xué)改善情況

統(tǒng)計分析100例COVID-19患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其治療后10天的淋巴細(xì)胞計數(shù)較治療前明顯上升(P<0.01)；白細(xì)胞數(shù)、LDH、CRP、AST較治療前明顯下降(P<0.05)； ALT較治療前無明顯差異。實(shí)驗(yàn)室檢查復(fù)常率均在65%以上，治療后10天，患者的CT影像學(xué)好轉(zhuǎn)率為71%；核酸轉(zhuǎn)陰率為62%；見表3和4。

2.3 當(dāng)歸芍藥散中活性成分篩選結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索當(dāng)歸芍藥散的活性成分，按照OB>30%及DL>0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選得到活性成分共51個(表5)，其中當(dāng)歸2個，白芍12個，川芎6個，白術(shù)7個，茯苓15個，澤瀉9個。繼續(xù)使用TCMSP檢索51個活性成分的作用靶點(diǎn)共227個，利用UniPort數(shù)據(jù)庫進(jìn)行轉(zhuǎn)換，獲得對應(yīng)的基因名共227個，去重后，剩92個(部分信息見表6，全部信息見補(bǔ)充數(shù)據(jù))。

表3 COVID-19患者CT影像好轉(zhuǎn)、核酸轉(zhuǎn)陰情況比較

表4 COVID-19患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

續(xù)表5(Continued Tab.5)

表6 當(dāng)歸芍藥散活性成分的部分靶點(diǎn)信息

2.4 當(dāng)歸芍藥散活性成分-COVID-19疾病靶點(diǎn)的預(yù)測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)COVID-19疾病相關(guān)靶點(diǎn)259個(部分信息見表7，全部信息見補(bǔ)充數(shù)據(jù))。利用Draw Venn Diagram網(wǎng)站，對當(dāng)歸芍藥散及COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到共同靶點(diǎn)18個，對應(yīng)的基因詳細(xì)信息見表8。當(dāng)歸芍藥散活性成分與COVID-19疾病相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)果由韋恩圖展示，見圖1。

表7 COVID-19疾病相關(guān)的部分靶點(diǎn)信息

表8 當(dāng)歸芍藥散活性成分與COVD-19相關(guān)的靶點(diǎn)信息

圖1 當(dāng)歸芍藥散中活性成分作用靶點(diǎn)與COVID-19疾病靶點(diǎn)交集

2.5 當(dāng)歸芍藥散活性成分與COVID-19疾病靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING網(wǎng)站，對此前分析得到的18個共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到其蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，利用Cytoscape3.6.1對STRING分析得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析(見圖2)，對該網(wǎng)絡(luò)圖而言，顏色越深，節(jié)點(diǎn)越大，節(jié)點(diǎn)自由度越高，重要性越強(qiáng)。

2.6 當(dāng)歸芍藥散復(fù)方-活性成分-COVID-19疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將表8中的18個共同靶點(diǎn)及其對應(yīng)的14個中藥活性成分輸入Cytoscape3.6.1中進(jìn)行分析，構(gòu)建當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，圖中節(jié)點(diǎn)間的連線，代表二者間的關(guān)系，連線越多的中藥活性成分或靶點(diǎn)，提示其可能為當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的關(guān)鍵成分或主要靶點(diǎn)。

圖2 當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 當(dāng)歸芍藥散-活性成分-作用靶點(diǎn)-COVID-19網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of Danggui Shaoyao Powder-active ingredients-target-COVID-19

2.7 當(dāng)歸芍藥散活性成分-疾病靶點(diǎn)的GO生物功能富集分析

將表8中的18個共同靶點(diǎn)輸入DAVID網(wǎng)站，進(jìn)行GO功能富集分析，包括生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)三方面，共得到180個條目(P<0.05)，運(yùn)用R語言對其顯著性進(jìn)行排序，分別取BP、CC、MF排名前10個條目做可視化分析(見圖4)。在生物過程中主要涉及對脂多糖的反應(yīng)，對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，對抗生素的反應(yīng)等；在細(xì)胞組分中主要涉及細(xì)胞膜，線粒體，微體等；在分子功能中主要涉及血紅素結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等。圖4中橫坐標(biāo)為GO功能富集條目名稱，縱坐標(biāo)為富集于該條目的基因數(shù)量。以上數(shù)據(jù)提示，當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的作用可能與上述生物功能密切相關(guān)。

2.8 當(dāng)歸芍藥散活性成分-疾病靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

將表8中的18個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入R語言，利用clusterProfiler程序包進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到109個條目(P<0.05)，對其排名前20個條目做氣泡圖展示(見圖5)，條目主要為：結(jié)核病、AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、Epstein-Barr病毒感染、沙門氏菌感染、TNF信號通路、弓形蟲病、麻疹、甲型流感、人類免疫缺陷病毒1型感染、人巨細(xì)胞病毒感染、百日咳、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、小細(xì)胞肺癌、查加斯病(美國錐蟲病)、阿米巴病、凋亡通路。圖5中縱坐標(biāo)為富集通路名稱，橫坐標(biāo)為富集于該通路的基因個數(shù)所占比例。Count代表富集于該通路的基因個數(shù)。以上數(shù)據(jù)提示，當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的作用可能與上述信號通路密切相關(guān)。

圖4 當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的作用靶點(diǎn)的GO功能富集結(jié)果Fig.4 GO functional enrichment results of action targets of Danggui Shaoyao Powder in the treatment of COVID-19

圖5 當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19的作用靶點(diǎn)的KEGG通路富集結(jié)果Fig.5 KEGG pathway enrichment results of action targets of Danggui Shaoyao Powder in the treatment of COVID-19

4 討論

COVID-19屬于祖國醫(yī)學(xué)“疫病”范疇，其臨床癥狀多樣化，可出現(xiàn)多個不同臟腑的癥狀，中醫(yī)診療過程中，應(yīng)注重整體觀念，結(jié)合實(shí)際時令運(yùn)氣，對患者進(jìn)行辨證施治。2020年中文括號庚子年) 歲運(yùn)為金運(yùn)太過，燥金之年。《素問·氣交變大論》言：“歲金太過，燥氣流行，肝木受邪。”可知在此燥金之年，由于肺屬金，故極易出現(xiàn)咳、痰、喘等肺系疾病。金克木，故亦可出現(xiàn)木臟疾病。治療上應(yīng)養(yǎng)陰潤燥、滋養(yǎng)肝血。新冠肺炎暴發(fā)于庚子年初之氣，病位在肺，累及肝脾，在清熱化濕解毒的基礎(chǔ)上，務(wù)必要結(jié)合金運(yùn)太過之年運(yùn)氣特點(diǎn)健脾氣、養(yǎng)肝血、護(hù)陰液，尤其是對于新冠肺炎重癥患者，由于病程較長，加之使用了大量耗氣傷陰之品，元?dú)獯髠委熒嫌绕淙绱恕．?dāng)歸芍藥散方中當(dāng)歸、川芎、白芍養(yǎng)肝血、潤肺燥；白術(shù)健運(yùn)脾土，兼燥濕；茯苓瀉肺之郁熱；澤瀉滲濕、瀉肺氣，全方具奏養(yǎng)、潤、運(yùn)、清之功。

本研究團(tuán)隊選用當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19重癥患者100例，取得良好療效。結(jié)果顯示，治療10天后，患者基本體征即體溫、心率較治療前明顯下降，氧飽和度較前明顯上升；主要癥狀具有發(fā)熱、咳嗽、咽干咽痛、乏力、胸悶氣促的患者人數(shù)較前明顯減少。住院天數(shù)為22.7±7.97天，核酸轉(zhuǎn)陰率為62%，CT影像好轉(zhuǎn)率為71%，實(shí)驗(yàn)室檢查復(fù)常率均在65%以上。以上結(jié)果表明當(dāng)歸芍藥散對于臨床治療COVID-19患者具有良好療效，因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)步探討其對于COVID-19的潛在作用機(jī)制尤為重要。

本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出當(dāng)歸芍藥散可能作用于COVID-19疾病的活性成分14個，包括芍藥苷、山奈酚、β-谷甾醇、楊梅酮、豆甾醇等。芍藥苷可通過減輕炎癥細(xì)胞浸潤和改善肺微血管通透性來對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷起保護(hù)作用[9]。山奈酚可有效抑制脂多糖引起的急性肺損傷中的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，進(jìn)而減輕氣道炎癥，減輕肺組織損傷[10]；其還可通過抑制炎癥反、改善肝細(xì)胞凋亡，從而對D-氨基半乳糖/脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭起保護(hù)作用[11]。β-谷甾醇可明顯抑制病毒感染引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕肺損傷，可用于預(yù)防或治療甲流的抗病毒藥物制備[12]。楊梅酮可抑制EB病毒復(fù)制，進(jìn)而減輕病毒感染[13]。豆甾醇可通過抑制活性氧(ROS)增加而發(fā)揮抗氧化作用，其還可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2(COX-2)及前列腺素E2(PGE2)發(fā)揮抗炎作用[14]。由上可見，當(dāng)歸芍藥散中諸多化合物具有抗病毒、抗炎、抗氧化等作用。提示其對新型冠狀病毒肺炎引發(fā)的肺損傷及肝損傷具有潛在的治療作用。

GO功能富集結(jié)果顯示，BP主要涉及對脂多糖的反應(yīng)，對氧化應(yīng)激的反應(yīng)，對抗生素的反應(yīng)等。脂多糖可通過激活CASP11，誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞焦亡，即細(xì)胞死亡同時釋放大量炎性因子，進(jìn)而引發(fā)急性肺損傷[15]。在機(jī)體肺損傷過程中，過度的氧化介質(zhì)會加重肺組織的損傷[16]。過度使用抗生素可出現(xiàn)微生物群耗竭，進(jìn)而引起肺損傷的加重，可表現(xiàn)為肺通透性增加，氧合指數(shù)增加，肺順應(yīng)性降低，肺勻漿中細(xì)胞因子/趨化因子水平升高[17]。以上結(jié)果提示當(dāng)歸芍藥散可能通過調(diào)節(jié)多種生物功能進(jìn)而對COVID-19疾病起治療作用。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19疾病涉及的主要通路為結(jié)核病、AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染及EB病毒感染等。其中結(jié)核病通路上富集的靶點(diǎn)最多，分別為CD14、CASP8、CASP3、Bax、Bcl-2、NF-κB、IL-6、STAT、iNOS。結(jié)核病通路尤為復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡、TLR、MAPK等多條信號通路。TLR及MAPK通路均為炎癥反應(yīng)過程中的重要通路，TLR啟動結(jié)合后，可激活NF-κB、p38及JNK，進(jìn)而引發(fā)IL-6、iNOS等多種炎癥介質(zhì)大量釋放，發(fā)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而對機(jī)體組織造成損傷[18]。肺損傷及肺纖維化中均可發(fā)生細(xì)胞凋亡，其中Bcl-2和Bax則是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[19]。同時，當(dāng)歸芍藥散可能通過乙肝病毒、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、EB病毒、IL-17等通路等發(fā)揮抗病毒、抗炎等作用，體現(xiàn)其對于COVID-19疾病的治療作用具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

綜上所述，當(dāng)歸芍藥散治療COVID-19可能通過其有效活性成分芍藥苷、山奈酚、β-谷甾醇、楊梅酮、豆甾醇等作用于結(jié)核病、AGE-RAGE、乙型肝炎、IL-17及EB病毒感染等信號通路發(fā)揮抗病毒、抗炎、抗氧化作用，進(jìn)而改善COVID-19患者的臨床癥狀。介于疫情期間醫(yī)療資源緊張，條件有限，本文中僅選取100例病例用于臨床研究，樣本量有限，統(tǒng)計結(jié)果只有一定的參考意義，且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身具有一定的局限性，本研究分析獲取的結(jié)果可能存在一定偏差，需今后在臨床中進(jìn)一步驗(yàn)證。