飛機草地上部分化學成分及其抑菌活性研究

譚亞婷，左安建，何彥儀，羅雨薇，胡世俊，閆曉慧*

1西南林業大學生物多樣性保護學院 云南省森林災害預警與控制重點實驗室；2西南林業大學林學院 西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，昆明 650224

飛機草(ChromolaenaodorataL.)又名香澤蘭，是一種多年生草本，屬于菊科(Compositae)澤蘭屬(Eupatorium)[1]。原產地為中、南美洲，現分布地區有非洲、大洋洲、亞洲和西太平洋群島大部分熱帶及亞熱帶地區[2]。通過有性生殖與無性生殖方式進行繁殖，其瘦果能借助冠毛隨風長距離傳播[3]。可分泌化感物質來抑制其周圍其他植物的生長，對生物多樣性造成極大的破壞[4]。因此，飛機草被列為世界各國重要檢疫性雜草之一[5]，飛機草主要化學成分有黃酮、萜類、生物堿等物質，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等生物活性[6-8]。在我國民間作為一種全草入藥且多外用的中草藥，其性溫，味道微酸，可用于跌打腫痛、瘡瘍腫毒、皮炎和外傷止血，還具有驅蟲、殺蟲的作用[9]。

核桃(JuglansregiaL.)的種植在云南省脫貧攻堅和美麗鄉村建設中發揮巨大的作用[10]，但近年來云南核桃種植地區的病害流行嚴重影響核桃的品質和產量，給種植戶造成了極大的經濟損失[11,12]，傳統化學防治存在環境污染、人畜安全、農藥殘留等安全隱患。隨著“綠色食品”概念的加強[13]，人們意識到對食品安全與人類健康息息相關[14]，不斷從植物中尋找具有生物活性的抗菌物質，開發對作物安全、高效、低毒、低殘留，對人體安全的新型植物源農藥[15]。因此，有效利用入侵植物的資源優勢也是控制其危害的方法之一[16]。本研究以入侵植物飛機草地上部分為材料，分離并鑒定化合物10個，其中,化合物2和8均首次從飛機草中獲得，抑菌活性成分集中于乙酸乙酯萃取物柱層析餾分2中，因此，進一步對該部分分離得到的化合物進行抑菌活性研究。為利用入侵植物飛機草，使其變廢為寶，達到減少環境破壞的目的，具有一定的社會、生態及經濟效益，同時為核桃真菌病害的綠色防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：DFY-C快速開蓋萬能高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；LT502電子天平(常熟市大量儀器有限責任公司)；N-1100旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；DL-1萬用電爐(天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠)；正相色譜硅膠(青島海洋化工廠)；MCI小孔樹脂、40～70 μm葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB公司)；反相色譜硅膠(德國默克公司)；ZF-6三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；Bruker DRX-500核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；WPL-230BE恒溫電熱培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；無菌超凈工作臺(蘇凈安泰工廠)；自動壓力蒸汽滅菌器(廈門致微儀器有限公司)。

試劑：工業純硫酸、分析純乙醇(云南楊林汕滇藥業有限公司)；工業純乙醇、石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇、丙酮經重蒸后使用(昆明鍇泰納工貿有限公司)；氘代氯仿、氘代丙酮、氘代甲醇(美國Cam- bridge Isotope Laboratories 公司)；水為實驗室自制蒸餾水。

1.2 材料與菌種

飛機草地上部分于2011年8月采自云南紅河，由西南林業大學胡世俊副教授鑒定為ChromolaenaodorataL.，植物標本存放于西南林業大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室。植物材料3.7 kg風干粉碎，按料液比1∶3加入95%乙醇，加熱回流提取4 h，共5次，提取液用旋轉蒸發儀濃縮回收溶劑，得提取物520 g，4 ℃下冷藏用于后期研究。

供試菌種為葉點霉(Phyllostictasp.)、炭疽菌(Colletotrichumsp.)、殼二孢(Ascochytasp.)、擬莖點霉(Phomopsissp.)，由西南林業大學生命科學學院陳玉惠教授提供，病原菌系從云南臨滄、大理、楚雄、曲靖、保山和昭通等縣(市)核桃主栽地區的398份感病核桃病葉和果實分離得到，用PDA培養基，于28 ℃培養箱中培養。

1.3 分離與鑒定

蒸餾水溶解粗提物，依次用等量石油醚、乙酸乙酯萃取三次，過濾，減壓濃縮得石油醚浸膏(114.38 g)、乙酸乙酯浸膏(145.78 g)，水萃取浸膏(167.32 g)。乙酸乙酯浸膏以石油醚/丙酮系統硅膠柱層析，濕法裝柱，干法上樣，依次用10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1梯度洗脫，濃縮得Fr.1(9.78 g)、Fr.2(8.69 g)、Fr.3(5.86 g)、Fr.4(7.56 g)、Fr.5(6.97 g)、Fr.6(10.62 g)。Fr.1經MCI色譜柱甲醇-水(10%→95%)分離，60%～70%部分采用葡萄糖凝膠色譜柱(丙酮)純化得無色透明塊狀結晶、白色粉末，為化合物1(683 mg)、2(592 mg)，剩余部分采用葡萄糖凝膠色譜柱(氯仿∶甲醇=1∶1)純化得白色粉末，為化合物3(168 mg)。Fr.2經MCI色譜柱甲醇-水(25%→100%)分離，其中25%-55%部分采用葡萄糖凝膠色譜柱(甲醇)純化得白色粉末，為化合物4(98 mg)；70%部分經重結晶析出白色針狀結晶，為化合物5(76 mg)，采用硅膠柱色譜分離70%部分，以石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑，洗脫梯度為30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1，5∶1部分經重結晶析出白色片狀結晶，為化合物6(42 mg)；70%～90%部分采用葡萄糖凝膠色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)純化得到白色片狀結晶，為化合物7(56 mg)。Fr.4經MCI色譜柱甲醇-水(20%→100%)分離，采用硅膠柱色譜分離60%部分，石油醚/氯仿/甲醇作為洗脫劑，洗脫梯度為62.5∶62.5∶1、30∶30∶1、15∶15∶1、8∶8∶1、4∶4∶1、2∶2∶1，62.5∶62.5∶1部分采用葡萄糖凝膠色譜(甲醇)淋洗后經硅膠柱色譜分離，石油醚/乙酸乙酯作洗脫劑，洗脫梯度為10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1，5∶1部分經重結晶析出黃色顆粒結晶，化合物8(426 mg)；30∶30∶1部分采用葡萄糖凝膠色譜(甲醇)純化得到無色透明結晶，為化合物9(354 mg)；15∶15∶1部分采用葡萄糖凝膠色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)純化得到黃色粉末，為化合物10(656 mg)。

采用1H NMR、13C NMR、MS等光譜學方法，各化合物在TLC中比移值以及表現出的物理化學特征等對所得單體化合物進行結構鑒定，并參照文獻，確定以上化合物化學結構。

1.4 飛機草粗提物抑菌活性檢測

分別稱取0.50 g供試植物乙醇提取物、不同萃取物、乙酸乙酯柱層析餾分溶解于分析DMSO溶液中，超聲輔助溶解制成100 mg/mL的粗提物母液。采用菌絲生長速率法對供試核桃病原真菌的抑制率進行測定。在無菌操作條件下，于50～60 ℃的PDA培養基中加入飛機草粗提物母液，稀釋為1 mg/mL的含藥培養基，同時以含等體積的DMSO溶劑的培養基的作為對照，含50 μg/mL苯醚甲環唑-DMSO溶液的培養基作為陽性對照，用直徑為4 mm打孔器在菌落邊緣生長一致的部分打取菌餅，將菌餅(有菌絲的面朝下)轉接于含藥平板中央，每個處理共5個重復，置于28 ℃恒溫培養箱中暗培養。采用十字交叉法每2天對各處理菌落生長直徑進行測定，對照菌落長滿至培養皿邊緣時結束測定，根據下列公式計算抑菌率：

對照純生長量(mm)=

對照組菌落直徑-菌餅直徑

(1)

處理純生長量(mm)=組菌落直徑-菌餅直徑

(2)

(3)

1.5 飛機草化學成分毒力測定

分別稱取3種化合物0.10 g，加入分析純DMSO溶液，超聲輔助溶解制成10 mg/mL的化合物母液。采用梯度法稀釋法分別在150 mL的PDA培養基中于50～60 ℃時加入0.75、1.50、2.25、3.00 mL化合物母液，稀釋成濃度為50、100、150、200 μg/mL的4個濃度梯度的含藥培養基，以加入等梯度的等體積DMSO為對照，每個處理共5個重復，接種與培養方式同“1.4”。參照陳麗華室內離體抑菌活性測定方法[17]，以藥劑質量濃度對數為橫坐標(x)，抑菌活性概率值為縱坐標(y)，采用數據軟件繪制毒力曲線，求得毒力回歸方程和相關系數，計算EC50，對不同植物粗提物的毒力大小進行比較。

1.6 數據處理

以上數據均采用Excel 2010軟件進行數據統計，運用SPSS17.0統計軟件(One-way ANOVA，Duncan post hoc test，P<0.05)進行多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物1無色透明塊狀結晶；ESI-MS:m/z345 [M+H]+得出化合物分子量為344，可判定該化合物分子式為C19H20O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.38(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′)，6.94 (2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，6.33(1H，d，H-8)，5.34(1H，dd，J=2.8，13.4 Hz，H-2)，3.94，3.86，3.83，3.82(各3H，s，4×OCH3)，3.02(1H，dd，J=13.4，16.7 Hz，H-3α)，2.75(1H，dd，J=2.9，16.7 Hz，H-3β)L13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.2(C-2)，45.4(C-3)，189.6(C-4)，154.3(C-5)，137.5(C-6)，159.5(C-7)，96.4(C-8)，160.0(C-9)，109.2(C-10)，130.7(C-1′)，127.7(C-2′，6′)，114.3(C-3′，5′)，159.8(C-4′)，61.7，61.4，56.1，55.4(4×OCH3)。上述數據與文獻[18]報道的已知化合物一致，因此鑒定為5，6，7，4′-四甲氧基黃烷酮。

化合物2白色無定形粉末；ESI-MS:m/z317 [M+H]+得出化合物分子量為316，可判定該化合物分子式為C17H16O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.02(1H，s，5-OH)，7.04(H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，6.93(2H，d，J=2.1，8.3 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J=8.3 Hz，H-5′)，6.06(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，6.04(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，5.32(1H，dd，J=3.0，13.0 Hz，H-2)，3.91(3H，s，OCH3)，3.80(3H，s，OCH3)，3.07(1H，dd，J=13.0，17.2 Hz，H-3α)，2.78(1H，dd，J=3.1，17.2 Hz，H-3β);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.0(C-2)，43.2(C-3)，196.0(C-4)，164.1(C-5)，95.1(C-6)，168.0(C-7)，94.3(C-8)，162.9(C-9)，103.2(C-10)，131.5(C-1′)，112.7(C-2′)，145.9(C-3′)，145.0(C-4′)，110.7(C-5′)，118.2(C-6′)，56.1，55.7(2×OCH3)。上述數據與文獻[19]報道的已知化合物一致，圣草素-7，4′-二甲醚。

化合物3白色粉末；ESI-MS:m/z317 [M+H]+得出化合物分子量為316，可判定該化合物分子式為C17H16O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.19(1H，s，5-OH)，7.37(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，H-6′)，6.95(2H，d，J=8.7 Hz，H-3′，H-5′)，6.11(1H，s，H-8)，5.34(1H，dd，J=2.9，13.1 Hz，H-2)，3.94(3H，s，6-OCH3)，3.83(3H,s ，4′-OCH3)，3.09(1H，dd，J=13.1，17.2 Hz，H-3α)，2.78(1H，dd，J=3.0，17.2 Hz，H-3β);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.1(C-2)，43.2(C-3)，196.9(C-4)，154.4(C-5)，128.3(C-6)，157.5(C-7)，94.6(C-8)，158.7(C-9)，103.1(C-10)，130.2(C-1′))，127.7(C-2′，6′)，114.2(C-3′，5′)，160.1(C-4′)，61.0(6-OCH3)，55.4(4′-OCH3)。上述數據與文獻[20]報道的已知化合物一致，判定該化合物為5，7-二羥基-6，4′-二甲氧基二氫黃酮。

化合物4白色絮狀粉末；ESI-MS:m/z303 [M+H]+得出化合物分子量為302，可判定該化合物分子式為C16H14O6。1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.51(2H，d，J=8.6 Hz，H-2′，H-6′)，6.99(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，H-5′)，5.99(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，5.95(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，5.12(1H，d，J=11.3，H-2)，4.68(1H，d，J=11.6，H-3)，3.83(3H，s，4′-OCH3);13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：84.1(C-2)，73.1(C-3)，198.2(C-4)，165.0(C-5)，97.1(C-6)，167.7(C-7)，96.0(C-8)，164.1(C-9)，101.5(C-10)，130.2(C-2′，6′)，114.4(C-3′，5′)，55.6(4′-OCH3)。上述數據與文獻報道[21]的已知化合物一致，判定該化合物為二氫山柰素。

化合物5白色針狀結晶；ESI-MS:m/z287 [M+H]+得出化合物分子量為286，可判定該化合物分子式為C16H14O5。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.37(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，H-6′)，6.95(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，H-5′)，5.97(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.99(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，5.37(1H，dd，J=3.0，13.1 Hz，H-2)，3.10(1H，dd，J=13.1，17.2 Hz，H-3α)，2.79(1H，dd，J=3.0，17.0 Hz，H-3β)，3.83(3H，s，4′-OCH3)，12.05(1H，s，5-OH);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.0(C-2)，43.1(C-3)，196.1(C-4)，164.4(C-5)，96.7(C-6)，164.3(C-7)，95.4(C-8)，164.4(C-9)，103.3(C-10)，130.3(C-1′)，127.8(C-2′，6′)，114.3(C-3′，-5′)，160.1(C-4′)，55.4(4′-OCH3)。上述數據與文獻報道[22]的已知化合物一致，因此鑒定為異野櫻素。

化合物6白色片狀結晶，ESI-MS:m/z331 [M+H]+得出化合物分子量為330，可判定該化合物分子式為C18H18O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.33(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.87(2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.34(1H，s，H-8)，5.33(1H，dd，J=2.8，13.4 Hz，H-2)，3.94，3.86，3.82(各3H，s，3×OCH3)，3.02(1H，dd，J=13.4，16.7 Hz，H-3α)，2.76(1H，dd，J=2.9，16.7 Hz，H-3β);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.2(C-2)，45.3(C-3)，189.8(C-4)，154.3(C-5)，137.5(C-6)，158.6(C-7)，96.4(C-8)，159.9(C-9)，109.1(C-10)，130.7(C-1′)，128.0(C-2′，6′)，115.7(C-3′，5′)，156.2(C-4′)，61.7，61.4，56.2(3×OCH3)。上述數據與文獻[18]報道的已知化合物一致，因此鑒定為4′-羥基-5，6，7-三甲氧基黃烷酮。

化合物7白色片狀結晶；ESI-MS:m/z37 ([M+H]+得出化合物分子量為374，可判定該化合物分子式為C20H22O7。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.25(2H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，6.94(2H，dd，J=2.2，8.8 Hz，H-6′)，6.90(1H，d，J=8.8 Hz，H-5′)，5.34(1H，dd，J=2.7，13.4 Hz，H-2)，3.04(1H，dd，J=13.5，16.7 Hz，H-3α)，2.77(1H，dd，J=2.8，16.7 Hz，H-3β)，3.87，3.82，3.94，3.92，3.90(各3H，s，5×OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：79.5(C-2)，45.5(C-3)，189.3(C-4)，154.3(C-5)，137.6(C-6)，159.8(C-7)，96.4(C-8)，159.5(C-9)，109.2(C-10)，131.1(C-1′)，109.4(C-2′)，149.3(C-3′)，149.5(C-4′)，111.2(C-5′)，118.9(C-6′)，61.7，61.4，56.2，56.0，56.0(5×OCH3)。上述數據與文獻報道[21]的已知化合物一致，判定該化合物為5，6，7，3′，4′-五甲氧基黃烷酮。

化合物8黃色顆粒結晶；ESI-MS:m/z359 [M+H]+得出化合物分子量為358，可判定該化合物分子式為C19H18O7。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.48(1H，d，J=8.5 Hz，H-6′)，7.39(1H，s，H-2′)，7.06(1H，s，H-6)，7.05(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.56(1H，s，H-3)，3.93，3.91，3.85，3.84(各3H，s，4×OCH3);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：164.0(C-2)，106.9(C-3)，179.6(C-4)，153.3(C-5)，97.9(C-6)，160.0(C-7)，141.8(C-8)，156.1(C-9)，112.6(C-10)，124.9(C-1′)，113.0(C-2′)，148.8(C-3′)，152.4(C-4′)，113.8(C-5′)，119.7(C-6′)，62.6，61.8，57.0，56.5(4×OCH3)。上述數據與文獻[22]報道的已知化合物一致，判定該化合物為3′-羥基-5，7，8，4′-四甲氧基黃烷酮。

化合物9無色透明針狀結晶；ESI-MS:m/z301 [M+H]+得出化合物分子量為300，可判定該化合物分子式為C16H12O6。1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.56(1H，dd，J=2.3，8.5 Hz，H-2′)，7.49(1H，d，J=2.3 Hz，H-6′)，7.13(1H，d，J=8.6 Hz，H-3′)，6.64(1H，s，H-3)，6.55(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.25(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.94(3H，s，4′-OCH3)，2.86(1H，s，5-OH);13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：163.3(C-2)，104.6(C-3)，183.0(C-4)，99.7(C-6)，164.9(C-7)，94.7(C-8)，158.8(C-9)，104.6(C-10)，124.8(C-1′)，119.7(C-2′)，112.4(C-3′)，151.7(C-4′)，147.8(C-5′)，113.6(C-6′)，56.4(4′-OCH3)。上述數據與文獻[23]報道的已知化合物一致，判定該化合物為香葉木素。

化合物10黃色粉末；ESI-MS:m/z285 [M-H]-得出化合物分子量為286，可判定該化合物分子式為C15H10O6。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.07(2H，d，J=8.9 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.9 Hz，H-3′，5′)，6.38(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=2.1 Hz，H-6);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：148.0(C-2)，137.1(C-3)，177.4(C-4)，158.3(C-5)，99.3(C-6)，165.6(C-7)，94.4(C-8)，162.5(C-9)，104.5(C-10)，123.7(C-1′)，130.7(C-2′，6′)，116.3(C-3′，5′)，160.6(C-4′)。上述數據與文獻[24]報道的已知化合物一致，判定該化合物為山柰酚。

圖1 化合物1～10的化學結構Fig.1 The chemical structures of the compounds 1-10

2.2 飛機草粗提物抑菌活性篩選

采用生長速率法測定了飛機草不同粗提物對四株核桃病原菌葉點霉、炭疽菌、殼二孢和擬莖點霉的抑菌活性，結果見表1。飛機草乙醇提取物、石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對葉點霉均表現出一定的抑菌活性抑菌率在45.45%～60.05%，其中,乙酸乙酯萃取物對葉點霉的抑菌作用最強，而水萃取物對葉點霉無抑菌活性。飛機草各提取物對炭疽菌和擬莖點霉的抑菌活性均較弱，抑菌率在6.74%～26.97%之間，其中水萃取物對擬莖點霉無抑菌活性。飛機草不同提取物對殼二孢均表現出較強的抑菌活性，抑菌率均在50%以上，其中，乙酸乙酯萃取物對殼二孢的抑菌率高達79.06%。上述結果表明，飛機草對供試四株核桃病原菌的，抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物中。因此，我們進一步對乙酸乙酯萃取物的抑菌成分進行了研究。

2.3 飛機草乙酸乙酯萃取物不同餾分的抑菌篩選

采用硅膠柱層析對飛機草乙酸乙酯萃取物進行了成分分離，獲得6個餾分，并對各個餾分的抑菌活性進行了測定。由表2可知，不同餾分對4種核桃病原真菌的抑菌作用表現出明顯差異。餾分1～3均能明顯抑制葉點霉的菌絲生長，餾分4～6對葉點霉的菌絲生長無影響，餾分2(石油醚∶丙酮=5∶1)部分對該病原菌菌絲生長抑制效果最強；餾分1-6均能抑制炭疽菌的菌絲生長，其中餾分2部分對炭疽菌抑菌活性最好；餾分1～3對殼二孢表現出良好的抑制作用，其中，餾分3的抑菌活性相對較高，餾分4～6對殼二孢無抑菌效果；餾分1～5均能對擬莖點霉表現出一定的抑制作用，抑菌率在11.22%～58.50%之間，其中餾分2的抑菌率最高，對菌絲生長的抑制作用最強，而餾分6對該病原菌無抑菌效果。綜上所述，有效抑制葉點霉、炭疽菌、殼二孢3種病原菌的成分主要集中在餾分2部分，抑制殼二孢的成分主要集中在餾分3部分。

表1 飛機草不同粗提物對4種核桃病原菌的抑菌活性

表2 飛機草乙酸乙酯萃取物不同餾分對4種核桃病原菌的抑菌活性

2.4 不同化合物對供試病原菌的抑菌活性

進一步以抑菌活性較好的餾分2部分離得到3個量大的化合物4、5、7為供試化合物，測定其對4種核桃病原真菌的抑菌毒力，結果表明不同化合物對各病原菌的毒力之間的差別顯著(表3)。其中，3個化合物對葉點霉、炭疽菌、殼二孢的抑菌活性強弱依次為：化合物5>化合物4>化合物7，其中抑菌活性最強的化合物5對上述三種菌的EC50分別為0.154 3、0.202 9、0.268 7 mg/mL，但仍均與陽性對照差異較大；對擬莖點霉的抑菌活性最強的仍是化合物5，其次為化合物7和化合物4，EC50分別為0.106 2、0.404 2、0.587 0 mg/mL，其中，化合物5(異野櫻素)對4種核桃病原菌均表現出較好的抑菌作用，該化合物對擬莖點霉菌絲生長抑制作用最強(圖2D-1)。4種菌株在PDA培養基中于28 ℃恒溫培養箱中暗培養，菌絲長勢均良好(圖2A～D)。菌絲初期均為白色，菌落中間的顏色在4天后出現變化，6天時最為明顯，且添加藥劑的菌落顏色較深于對照。葉點霉菌落中間為淡墨綠色，白色絨毛狀菌絲附于外圍，炭疽菌菌落中間為淡橘紅色，外圍菌絲呈白色，殼二孢菌落中間為墨綠色且占比例較大，外圍僅有一圈白色絨毛狀菌絲，擬莖點霉菌落出現明顯的顏色分圈，苯醚甲環唑處理后能明顯抑制各病原菌菌絲生長。

表3 3種化合物對4種核桃病原菌的相對毒力

圖2 150 μg/mL異野櫻素對核桃病原菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of 150 μg/mL of isosakuranetin on pathogenic fungi from J.regia注：A～D：葉點霉、炭疽菌、殼二孢，擬莖點霉；1～3：異野櫻素、對照、陽性對照。Note:A-D:Phyllosticta sp.,Colletotrichum sp.,Ascochyta sp.,Phomopsis sp.;1-3:Isosakuranetin,control group and positive control group.

3 討論與結論

本研究為進一步探究飛機草的抑菌活性，對飛機草地上部分進行系統的分離，從乙酸乙酯層共分離得到10個化合物，包括6個二氫黃酮、1個二氫黃酮醇、2個黃酮、1個黃酮醇，其中有化合物2、8首次從飛機草中分離獲得。研究報道，黃酮化合物是飛機草葉片中主要次生代謝物質，在飛機草的防御和競爭中具有重要作用，能使飛機草在入侵過程通過強抗性和強化感活性去突破新天敵和新的競爭者的阻礙[25]。因此，推測黃酮化合物是飛機草成功入侵的特征成分。植物為抵御來自于環境或其它生物物種的外來傷害逐漸形成了基于特異性的作用機制形成的化學防御物質，使其在長期進化和自然選擇中占有明顯優勢[26]，植物源活性物質可作為抑菌主要成分[27]，對今后開發為新型的天然抗菌劑具有重要意義。

目前常用乙醇提取植物中次生代謝，但不同的提取溶劑對植物抑菌效果具有不同影響[28]。本研究對飛機草各粗提物進行抑菌活性篩選，發現1 mg/mL乙酸乙酯萃取物對4種核桃病原真菌的抑制活性高于乙醇提取物、石油醚萃取物、水萃取物，可能是抑制核桃病原菌的活性成分極性與乙酸乙酯極性相似。該萃取物經硅膠柱色譜分離劃段得到6個餾分，比較發現餾分2部分能夠有效抑制葉點霉、炭疽菌、擬莖點霉病原菌，抑制率分別為67.54%、40.69%、58.50%，抑制殼二孢的成分主要集中在餾分3部分，進一步測定了餾分2部分分離得到的量大的化合物4、5、7對4種核桃病原真菌的抑菌毒力。化合物4、5對4株病原菌的整體抑制作用優于化合物7，其中，化合物5對4種核桃病原菌的抑菌活性均較好，其對各病原菌的EC50分別為擬莖點霉0.106 2 mg/mL、葉點霉0.154 3 mg/mL、炭疽菌0.202 9 mg/mL、殼二孢0.268 7 mg/mL，該結果與已報道的A環的5-OH、7-OH為重要抗菌活性基團相吻合[23]。此外，化合物結構中的甲氧基存在，也是其抑菌的活性基團，研究報道該類化合物可有效抑制菌膠包炭疽菌，且抑菌效果隨濃度的增加而增強[29]。黃酮類化合物因其具有較高的抑菌活性，很早就被應用于抑菌治療[30]。

綜上所述，飛機草乙醇提取物中抑核桃病原菌的活性成分集中于乙酸乙酯層，而異野櫻素是該萃取層的主要活性物質。飛機草富含黃酮化學成分，黃酮類抑菌活性顯著[39]。今后可進一步圍繞黃酮類成分進行抑菌先導化合物的開發，為飛機草的治理和綜合利用奠定基礎，也為開發為新型殺菌劑提供理論依據。

致謝：感謝西南林業大學生命科學學院陳玉惠教授提供供試菌種。