草甘膦對茶樹葉片主要生化成分的影響

郭永春，王淑燕，王鵬杰，陳金發，周 鵬，歐陽立群，趙 峰，葉乃興*

1福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福州 350002；2福建中醫藥大學藥學院，福州 350122；3國家茶葉質量安全工程技術研究中心，安溪 362400；4福建省產品質量檢驗研究院，福州 350002

茶樹Camelliasinensis(L.) O.Kuntze是一種多年生葉用經濟作物，在世界上多個國家被廣泛種植[1]。雜草可與茶樹爭奪肥水和生長空間，影響茶葉產量和品質[2]，草甘膦是一種常見的內吸傳導型除草劑，具有高效、廉價和殺草譜廣等優點，近幾十年來在茶園雜草管理中被廣泛應用[1]。現階段，我國的福建、貴州等部分省份已通過地方法規限制茶園使用草甘膦，但生產中依舊難以避免由于不合理用藥導致的茶園草甘膦污染[3]。

草甘膦具有廣譜性，在殺滅雜草的同時，也會被作物根部吸收并轉運至全株，影響作物生長代謝[4]。其作用機理是通過干擾植物莽草酸代謝途徑，影響芳香氨基酸的合成，使植物代謝紊亂，因此草甘膦作用于植物莽草酸代謝的過程必然會影響農作物的品質[5]。已有研究表明，草甘膦施用后，玉米[6]、馬鈴薯[5]和柑橘[7]等農作物的產量下降。也有學者開始關注草甘膦對茶樹生長和代謝的影響，例如，Gao等[8]指出，茶園施用田間推薦劑量的草甘膦除草劑后，茶樹地上部未有藥害表征；Tong等[9]通過水培體系研究發現，草甘膦經茶樹根部吸收后轉運到葉部，極有可能是茶葉中草甘膦殘留的主要途徑。本課題組前期通過對幼齡和成年茶樹施用草甘膦發現，噴灑到土壤的草甘膦被茶樹根部吸收后，經莖部轉運富集至葉部[10]。目前，草甘膦的施用對茶樹葉片主要生化成分(如：氨基酸、兒茶素和生物堿)的具體影響尚未見報道。

本研究通過觀察草甘膦施用后茶樹葉片的表觀藥害，并對草甘膦施用前(0天)和施用后(7和33天)茶樹葉片中的農藥殘留(草甘膦和氨甲基膦酸)及主要生化成分(兒茶素、生物堿和氨基酸)進行定量測定，從而探究草甘膦施用后茶樹葉片的表觀藥害、草甘膦在茶樹葉片中的代謝情況及其施用對茶葉主要生化成分的具體影響，相關試驗結果可為草甘膦在茶葉生產質量的安全管控方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料處理及制備

以全國優良品種金觀音(C.sinensis‘Jin-guanyin’)一年生茶樹為試驗材料，將泥炭土和珍珠巖按照1∶1(體積比)混勻后作栽培基質。將茶樹植于體積為2 L的盆缽并進行2個月的適應性培養，選取長勢基本一致的植株，于2019年10月將草甘膦異丙胺鹽定量施于栽培基質上，具體方法為：(1)分別將45、450和900 mg/mL的草甘膦施于栽培基質(每單位體積土壤基質的施用量，即濃度分別為0.3 mg/mL(低于推薦施用濃度)、3 mg/mL(推薦施用濃度)和6 mg/mL(高于推薦施用濃度)的草甘膦在每個盆缽(2 L)定量噴施300 mL)，取茶樹葉片進行藥害表征觀察。(2)將45 mg/mL的草甘膦施于栽培基質(濃度為0.3 mg/mL的草甘膦在每個盆缽(2 L)定量噴施300 mL)，分別于0(施用前)、7和33天采集茶樹嫩梢第二三葉(每個時期6次生物學重復)，采集后的樣品以液氮速凍，通過冷凍干燥機干燥后，放入研缽磨碎成粉，用于農藥殘留及茶葉品質化學組分的測定。

1.1.2 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS，美國Agilent公司)；超高效液相色譜串聯-飛行時間質譜連用儀(UPLC-TOF-MS，美國Wateser-G2-S公司)。

試劑：草甘膦異丙胺鹽(有效成分30%，山東三農生物科技有限公司)；草甘膦標準品草甘膦內標(1，2-C13N15草甘膦，上海安譜有限公司)；乙酸銨、甲酸和36%鹽酸(色譜純，西隴科學股份有限公司)；十水四硼酸鈉和磷酸二氫鉀(分析純，西隴科學股份有限公司)；甲酸銨(試劑級，西隴科學股份有限公司)；乙腈和甲醇(色譜級，山東禹王和天下新材料有限公司)；氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，分析純，純度不低于99.0%，上海源葉生物科技有限公司)；60 mg/3 mL陽離子交換柱(PCX,博納艾杰爾科技公司)；氨基酸衍生試劑盒(美國Waters公司)。

茶氨酸(theanine，Thea)、天冬酰胺(asparagine，Asn)、谷氨酰胺(glutamine，Glu)、豆葉氨酸和L-胱氨酸購自成都德思特生物技術公司；氨基酸混合標準儲備液購自美國Sigma公司，包括：天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、絲氨酸(serine，Ser)、甘氨酸(glycine，Gly)、組氨酸(histidine，His)、蘇氨酸(threonine，Thr)、丙氨酸(alanine，Ala)、精氨酸(arginine，Arg)、色氨酸(tryptophan，Try)、脯氨酸(proline，Pro)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、纈氨酸(valine，Val)、蛋氨酸(methionine，Met)、賴氨酸(lysine，Lys)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、瓜氨酸(citrulline，Cit)、肌氨酸(sarcosine，Sar)、異亮氨酸(isoleucine，Ile)、乙醇胺(ethanolamine，EOHNH2)、鳥氨酸(ornithine，Orn)、DL-β-氨基異丁酸(β-aminoisobutyric acid，β-AiBA)、l-α-氨基己二酸(α-aminoadipate，α-AAA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、L-亮氨酸(leucine，Leu)、羥賴氨酸(hydroxylysine，Hy-Pro)、L-肌肽、半胱氨酸、羥基-L-脯氨酸、尿素、鵝肌肽、牛磺酸、δ-1-甲基-L-組氨酸、高胱氨酸、L-α-氨基丁酸、3-甲基-L-組氨酸、β-丙氨酸、L-肌酸酐、胱硫醚、氯化銨；兒茶素(catechin，C)、表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、沒食子兒茶素(gallocatechin，GC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallic acid catechin gallate，GCG)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate，CG)等8種兒茶素單體標準品購自香港Farco chemical supplies公司；茶葉堿和咖啡堿(caffeine，CA)標準品購自香港Farco chemical supplies公司；可可堿(theobromine，TB)標準品購自Stanford Chemicals公司，標準品純度均大于98%。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 草甘膦及氨甲基磷酸的測定

按照SN/T 3983-2014《出口食品中氨基酸類有機磷除草劑殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》以UPLC-MS/MS測定樣品中的草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸的含量。

1.2.2 游離氨基酸及其衍生物的測定

按照Chen等[11]的方法，具體如下：稱取0.050 g待測茶樣，加純水定容至5 mL，渦旋混勻，于25 ℃超聲提取30 min，上清液移入離心管離心5 min，取10 μL經0.22 μm PTFE濾膜過濾的提取液與70 μL AccQ-Fluor硼酸鹽緩沖液(PH=8.8)混合，加入20 μL AccQ-Fluor試劑(3 g/L)，渦旋后于55 ℃烘箱中反應10 min，冷卻至室溫后采用UPLC-MS/MS進行測定。

色譜條件：HSS T3 C18色譜柱(Waters,2.1×150 mm,1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流動相A：甲酸銨水溶液(10 mmol/L)，流動相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；洗脫梯度：0～12 min，0%→20% B；12～16 min，20%→35% B；16～18 min，35%→90% B；18～20 min，90%→5% B；進樣體積：0.5μL。質譜條件：電噴霧電離，正離子模式；多反應監測模式；電噴霧電壓，4.5 kV；氣簾氣壓力：0.21 MPa；霧化氣壓力：0.38 MPa；輔助氣壓力：0.38 Mpa；輔助氣溫度550 ℃。

1.2.3 生物堿和兒茶素組分的測定

按照Zhou等[12]的方法，具體如下：稱取0.100 g待測茶樣，加提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶1∶3，V/V)定容至5mL，渦旋后于室溫下超聲提取30 min，15 000 rpm離心3 min，取上清液至離心管，過0.22 μm PTFE濾膜后采用超高效液相色譜串聯-飛行時間質譜連用儀UPLC-TOF-MS進行測定。

色譜條件：HSS T3色譜柱(Waters,100×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流動相 A：0.1 %甲酸，流動相 B：乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～10 min，95%→75% B；10～13 min，75%→48% B；13～15 min，48%→20% B；15～15.01 min，20%→5% B；15.01～17 min，5%B；17～17.01 min，5%→95% B；進樣體積：5 μL。質譜條件：電噴霧電離，負離子模式；毛細管電壓：2.5 kV；掃描范圍：50～1 200 Da；離子源溫度：120 ℃；去溶劑化溫度：400 ℃；去溶劑化流速：800 L/h。

1.3 數據統計與分析

通過Excel 2010進行數據統計，以“平均值±標準偏差”表示每個處理組的試驗結果；采用IBM SPSS Statistics 19.0的ANOVA進行組間差異顯著性分析；將游離氨基酸、生物堿和兒茶素的定量結果進行標準化處理后以Tbtools繪制熱圖；采用SIMCA P 14.1軟件進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)；采用Origin 2019軟件作柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 草甘膦施用后茶樹葉片的藥害表征及其殘留

由圖1A可知，45、450和900 mg/L的草甘膦施用33天，相較于未施藥前(0天)，茶樹生長正常，葉片未出現干枯、皺縮和脫落等常見藥害表征。現階段，國家食品安全標準GB 2763—2019規定茶葉中草甘膦的最大殘留限量(maximum residue limits，MRLs)為1.0 mg/kg[3]，如圖1 B所示，即使在45 mg/L較低施藥劑量下，茶樹葉片在7天和33天均檢測到草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid，AMPA)殘留。葉片中的草甘膦含量在7天較高，達到2.6 mg/kg(大于MRLs)，在33天已降低至0.33 mg/kg(小于MRLs)；AMPA含量在7天達0.21 mg/kg，在33天降低至0.08 mg/kg。

圖1 草甘膦施用不同時間后的葉片表征(A)及茶樹葉片中的草甘膦和氨甲基膦酸含量(B)Fig.1 Observation of the phytotoxicity (A) and the content of PMG and AMPA in tea leaves (B) under the spraying of PMG at different times

2.2 草甘膦對茶樹葉片游離氨基酸含量的影響

本試驗樣品共定量到28個游離氨基酸組分(見表1)，其中的27個游離氨基酸組分的含量在施藥后發生顯著性變化(P<0.05)，游離氨基酸總量在草甘膦施藥7天和33天均顯著降低(P<0.05)。茶氨酸的含量在7天和33天下降較明顯，降幅分別達到38.03%和62.03%；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的含量在草甘膦施用后7天升高，在施用后33天降低并低于施用前(0天)。此外，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、組氨酸、蛋氨酸、鳥氨酸的含量在7天和33天均顯著降低；肌氨酸、羥脯氨酸、賴氨酸和精氨酸的含量在草甘膦噴施后7天變化不顯著，在3天后顯著上升；蘇氨酸、丙氨酸和γ-氨基丁酸在7天變化不顯著，在33天顯著降低；脯氨酸、纈氨酸、天冬酰胺、異亮氨酸、乙醇胺、L-2-氨基己二酸和絲氨酸的含量在7天顯著升高，在33天顯著降低；β-氨基異丁酸和亮氨酸在7天顯著升高，在33天變化不顯著。

表1 草甘膦施用對茶樹葉片游離氨基酸組分含量的影響(n=6)

2.3 草甘膦對茶樹葉片兒茶素類化合物含量的影響

本試驗共有6個兒茶素組分的含量高于定量限(見表2)，其中，6個兒茶素組分的樣品組間存在顯著性差異(P<0.05)，兒茶素總量在草甘膦施用后7天和33天均顯著下降。此外，草甘膦施用后，C和EC的含量在7天降低，在33天升高；而EGC和GC的含量在7天升高，在33天降低；ECG和EGCG(酯型兒茶素)的含量在7天和33天均下降。

表2 草甘膦施用對茶樹葉片兒茶素組分含量的影響(n=6)

2.4 草甘膦對茶樹葉片生物堿類化合物含量的影響

本試驗樣品共定量到2個生物堿組分(見表3)，2種生物堿組分的樣品組間均存在顯著性差異(P<0.05)，生物堿總量在草甘膦施用后7天顯著升高，在33天顯著下降。可可堿的含量在7天和33天均持續性地顯著降低，而咖啡堿的含量在7天顯著上升，在33天顯著降低且低于處理前(0天)。

2.5 草甘膦對茶樹葉片主要生化成分影響的多元統計分析

2.5.1 熱圖可視化分析

為更直觀地反映各組間樣品的含量變化規律及組內樣品的聚集模式，將上述生物堿、兒茶素和游離氨基酸組分的定量結果進行標準化并繪制熱圖。如圖2所示，組內樣品聚集良好，組間樣品得以完全區分。36種化學組分按照其含量變化特征聚為兩類：A類中的7個組分含量在33天明顯升高，B類中的27個組分含量在33天明顯下降。其次，A1類4個組分含量在7天變化不明顯，A2類3個組分含量在7天下降；B1類18個組分含量在7天升高，B2類9個組分含量在7天下降，GC和Cit的變化趨勢不明顯。

表3 草甘膦施用對茶樹葉片生物堿含量的影響(n=6)

圖2 草甘膦施用后茶樹葉片中36種化學組分的含量熱圖Fig.2 Heat map of 36 chemical components in tea leaves after glyphosate applying注：顏色刻度表示標準化轉換后的值，藍色表示低含量水平；紅色表示高含量水平。Note:The color scale indicates the standardized converted value,blue indicates a low content level;red indicates a high content level.

2.5.2 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

為進一步確定各組樣品間的差異，對36種茶葉代謝組分進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。由圖2A可知，模型累積方差貢獻率為95.3%，預測準確率為98.5%，表明了該模型用于區分樣品的可行性。圖3B顯示了PLS-DA模型的交叉驗證結果，圖中左側所有的R2和Q2點均低于最右側的R2和Q2原始點，縱軸低截距(R2=0.174，Q2=-0.361)進一步表明原始模型的有效性。由圖2 B可知，0天、7天和33天的樣品分別位于第四、一和三象限，0天和7天的樣品在t[2]軸上完全分開，0天和33天的樣品在t[1]軸上完全分開，7天和33天的樣品需t[1]軸和t[2]軸相結合才能區分。由此可見，草甘膦噴施后7天和33天的樣品差別較小，而與草甘膦噴施前的樣品(0天)存在較大差異。

如圖3D所示，共有10種化合物的VIP(variable importance for the projection,VIP)值大于1，變量VIP值由高至低依次是茶氨酸(Thea)、咖啡堿(CA)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、谷氨酰胺(Gln)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和表沒食子兒茶素(EGC)。此外，這10種化合物在因子載荷圖(見圖3C)中發現這些化合物均屬于離密集區較遠的變量。

3 討論

3.1 草甘膦施用后茶樹葉片的表觀藥害及農藥殘留情況

Tong等[9]研究發現，水培營養液中的草甘膦濃度達到200 mg/L時，茶樹葉片會出現黑褐色斑點；Gao等[8]研究發現，推薦劑量的草甘膦噴灑到茶園后，茶樹嫩梢生長正常。課題組前期研究發現，1.5～15 g/m2劑量的草甘膦噴灑到成年茶樹根部后，茶樹地上部未觀察到藥害產生[10]。本試驗與后二者研究結果相似，45～900 mg/L劑量的草甘膦噴灑到幼齡茶樹的栽培基質后，茶樹生長正常。此外，在45 mg/L較低施藥劑量下，茶樹葉片在7天檢測到較高草甘膦(大于MRLs)及AMPA殘留，在較長施用間隔期后(33天)仍可檢測到少量草甘膦(小于MRLs)及AMPA殘留。AMPA 作為草甘膦的主要降解產物，是一種植物毒素，對哺乳動物具有長期的毒性作用[13]，說明茶園草甘膦的施用不易使茶樹葉片產生藥害表征，但在葉片中殘留時間久且存在草甘膦殘留超標及AMPA生物毒性的風險。

3.2 草甘膦對茶樹葉片主要生化成分的影響

草甘膦通過抑制植物莽草酸代謝途徑中的關鍵酶活性，影響3種芳香氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的生物合成[14]。本研究顯示，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的含量在草甘膦施用后7天升高，在33天降低并低于施用前(0天)，原因可能是茶樹在初期對草甘膦產生逆境響應，3種氨基酸的含量升高，而后草甘膦持續抑制EPSPS活性，最終導致3種氨基酸的含量下降。草甘膦作用于植物莽草酸代謝的過程可間接影響生物堿類化合物和部分次生代謝物(如：茶氨酸和兒茶素)的合成[15]。Malalgoda等[16]指出，草甘膦對小麥的氨基酸代謝具有負面影響；Rainio等[17]通過對馬鈴薯的土壤基質進行草甘膦處理，發現植株內的糖苷生物堿濃度下降。與之研究結果相似，草甘膦施用后，茶葉中的特征氨基酸—茶氨酸含量大幅降低，可可堿、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量顯著下降，說明施用草甘膦可能通過抑制莽草酸代謝途徑，間接阻止這些化合物的生物合成。此外，游離氨基酸、兒茶素和生物堿的總量及其組分構成，對茶葉品質具有重要作用[18]。草甘膦施用后，游離氨基酸和兒茶素總量降低，生物堿總量先升后降；2個生物堿、5個兒茶素和27個游離氨基酸組分的含量發生顯著變化(P<0.05)。說明施用草甘膦改變了茶樹葉片中游離氨基酸、兒茶素和生物堿類化合物的總量及其組分構成，影響鮮葉品質。

PLS-DA模型的因子載荷圖中離密集區越遠的變量對分類越關鍵[19]，VIP總結變量X(代謝組分)和自變量Y(樣品)相關性，VIP值大于1，表示該代謝組分對樣品組間區分的貢獻較大[20]，共有10個化合物的VIP值大于1，且在因子載荷圖中屬于離密集區較遠的變量，依次是茶氨酸、咖啡堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、谷氨酰胺、表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和表沒食子兒茶素。此外，這10個化合物的絕對含量在0、7和33天均具有顯著差異(P<0.05)，因此，這10個化合物是區分茶樹草甘膦施用前(0天)和施用后(7天和33天)的關鍵化合物。

4 結論

草甘膦在茶樹葉片中殘留時間較長，并存在草甘膦殘留超標及AMPA生物毒性的風險；其次，草甘膦的施用能夠間接阻止茶樹葉片中茶氨酸、可可堿、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯等組分的合成，并改變茶樹嫩梢的游離氨基酸、兒茶素和生物堿類化合物的總量及其組分構成，最終影響鮮葉品質。此外，通過多元統計分析篩選出10個茶樹草甘膦施用前后差異較大的關鍵化合物，變量VIP值由高至低依次為：茶氨酸、咖啡堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、谷氨酰胺、表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和表沒食子兒茶素。因此，建議在茶葉生產中盡量不使用草甘膦除草劑。