淫羊藿總黃酮通過TGF-β1/Smad3信號通路改善自然衰老大鼠腎臟組織纖維化

蓋李樂，袁 丁，張長城，夏宗保，石 越，高 艷，袁成福*

1三峽大學醫學院，宜昌 443000；2荊門市第一人民醫院，荊門 448000

隨著人口老齡化的到來，年齡相關性疾病的發病率呈現出顯著增長趨勢，經大數據統計，近10年來慢性腎病的患病率已高達10%[1]。腎臟是人體最重要的代謝器官之一，在維持正常的生命活動中起著至關重要的作用。隨著年齡增長，衰老所伴隨發生的腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質纖維化，使得腎臟結構及血流動力學發生改變，腎功能進行性惡化甚至喪失[2-4]。腎纖維化是慢性腎病的終末期表現，一旦發生，嚴重影響患者的生活質量以及生存時間，因此，尋找防治衰老相關纖維化的有效藥物具有重要的醫學價值和社會意義，積極地改善腎臟組織慢性損傷和纖維化，是防治慢性腎病的重要環節。

淫羊藿(Herba Epimedii)又名仙靈脾，是一味常見的傳統天然補腎中藥，性溫，走肝腎二經，具有補腎壯陽、強筋健骨、祛風除濕之功效，其藥用歷史悠久[5]。淫羊藿總黃酮(total flavonoids of Herba Epimedii，TFE)是淫羊藿的有效成分，現代藥理學研究顯示，TFE具有改善骨質疏松[6]、心血管疾病[7]、睪丸病變[8]的功效，同時可通過促進細胞增殖、抗氧化、抗炎等多種途徑來抵抗衰老[9]，具有較大的研究價值。本課題組前期研究顯示，TFE能通過調節IRE1α/XBP1信號通路改善自然衰老大鼠睪丸支持細胞的分泌功能[10]；TFE還可通過抑制MAPK/NFκB信號通路改善自然衰老大鼠的腦部炎癥，延緩腦衰老[11]。多項報道顯示淫羊藿能夠有效抵抗多部位臟器衰老，然而其能否改善腎臟衰老所致的纖維化卻鮮有報道。因此，本研究通過觀察TFE對自然衰老大鼠腎臟形態、功能以及αSMA、TGFβ1、Smad3蛋白表達水平的影響，來探討TFE對自然衰老大鼠腎臟組織纖維化的影響及其作用機制，為豐富淫羊藿在衰老相關性疾病的防治提供有力的實驗依據。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗藥物

淫羊藿總黃酮購于成都仁誠生物科技有限公司，其純度為80%，用1%羥甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)配置成相應濃度的溶液。

1.2 實驗動物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性SD大鼠18月齡36只、2月齡10只，購自北京維通利華技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001，分籠飼養于三峽大學實驗動物中心SPF級屏障系統，溫度22±2 ℃，濕度60%±5%，光照明暗交替，飼養期間大鼠均自由攝食飲水。

1.3 實驗試劑

Trizol、逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(大連寶生物科技有限公司)；PCR引物(生工生物工程股份有限公司)；SOD試劑盒、MDA試劑盒、Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)；β-actin抗體(美國Santa cruz公司)；α平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，αSMA)抗體(美國Santa cruz公司)；轉化生長因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)抗體(美國Abcam公司)；Smad3抗體(美國CST公司)。

1.4 實驗儀器

MICROM GmbHHM340E超薄切片機(德國MICROM)；StepOnePlusTM實時定量PCR儀(美國Applied Biosysterms)；TYPE1500-458全波長酶標儀(美國Thermo Electron)；PowerPacTMBasic電泳儀(美國Bio-Rad)；Bioshine ChemiQ4800化學發光成像自動顯影儀(中國歐翔科學儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及處理

將36只18月齡雄性SD大鼠適應性喂養一周后，隨機分為3組：自然衰老組、TFE低劑量組(10 mg/kg)、TFE高劑量組(40 mg/kg)，每組12只，10只2月齡大鼠為青年對照組。每日定時給予大鼠灌胃1次，共計給藥4個月。根據大鼠體重，TFE低、高劑量組給予相對應濃度的藥物灌胃，青年對照組及自然衰老組分別給予體重相對應的1% CMC-Na溶液灌胃，每周稱量一次體重，根據體重調整灌胃容量。

2.2 腎臟組織的收集及保存

大鼠喂養4個月后，在取材前稱量大鼠體重；麻醉后用脫頸法處死，組織剪沿皮膚及皮下組織各層剖開胸腹腔，迅速摘取大鼠腎臟等組織，用預冷的PBS清洗后濾紙吸干多余液體，一部分腎臟組織過液氮后凍存在-80 ℃，另一部分腎臟縱行切開后浸泡于4%多聚甲醛用于HE染色和免疫組化實驗。

2.3 HE染色和Masson染色觀察腎臟組織形態和膠原沉積

腎臟標本用4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，經蘇木精和伊紅染色(HE staining)后在光學顯微鏡下觀察腎臟病理改變，Masson染色評估腎臟組織膠原沉積情況。在200倍鏡下每張切片隨機選取5個不同視野，呈現藍色的區域為膠原纖維，藍色區域的面積與整個視野總面積的比值為腎臟纖維化指數。采用Image Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析。

2.4 檢測腎臟組織SOD活力及MDA含量

稱取100 mg腎臟組織，加入1 mL預冷的PBS緩沖液制備成10%勻漿，用冰凍離心機4 ℃ 3 500 rpm離心15 min，吸取上清液，按照試劑盒步驟，分別采用黃嘌呤氧化酶法和TBA法檢測腎臟組中的SOD活力和MDA含量。

2.5 Real-time PCR檢測mRNA表達水平

稱取40 mg腎臟組織，加入Trizol充分裂解，再依次加氯仿、異丙醇、75%乙醇抽提RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，核酸儀檢測RNA濃度，經逆轉錄得到cDNA。反應體系為：SYBR 5 μL，超純水3.4 μL，引物0.4 μL(上、下游引物各0.2 μL)，Dye 0.2 μL，cDNA 1 μL，在ABI StepOneplusTM儀器進行擴增，反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，共40個循環。每個樣本2個復孔，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT計算出目的基因相對表達量。

表1 PCR引物序列

2.6 免疫組化法檢測大鼠腎臟組織αSMA的表達

腎臟組織石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，檸檬酸鹽修復液高壓修復10 min，PBS沖洗后滴加3%過氧化氫37 ℃孵育10 min，再PBS沖洗，用5% BSA室溫下封閉1 h，滴加一抗(1∶200)4℃孵育過夜后滴加二抗，室溫孵育1 h，PBS沖洗3遍，用DAB顯色液顯色，蘇木精復染、鹽酸酒精分化后，自來水沖洗，干燥后封片。鏡下觀察到陽性表達呈現棕黃色，在200倍鏡下隨機選取5個不同視野，用Image Pro Plus 6.0軟件分析陽性表達的相對面積。

2.7 Western blot檢測腎臟組織TGF-β1及Smad3的蛋白水平表達

稱取40 mg腎臟組織，加入裂解液高速研磨30 s，渦旋儀振蕩15 s，冰上靜置10 min，重復3次，4 ℃下12 000 rpm離心15 min，用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸10 min。制備SDS-PAGE凝膠，電泳并轉印至PVDF膜上，5%牛奶室溫下封閉1 h，4 ℃下一抗孵育過夜，TBST洗膜后在室溫下孵育二抗1 h，洗膜后用ECL化學發光液顯影。

2.8 統計學方法

3 實驗結果

3.1 TFE對自然衰老大鼠腎臟組織病理形態的影響

如圖1HE染色圖片所示，與青年對照組相比，自然衰老組大鼠腎臟腎小球血管袢增生，腎小管擴張，廣泛炎性細胞浸潤，局部有點片狀萎縮壞死，大量膠原纖維增生；而與自然衰老組相比，TFE低、高劑量組大鼠腎臟組織中腎小管擴張程度減輕，炎性細胞數量減少，膠原纖維明顯減少，形態結構明顯改善。

3.2 TFE對自然衰老大鼠腎臟組織膠原沉積的影響

由圖2 Masson染色可見，腎臟組織中腎小球上皮細胞胞漿、間質細胞胞漿等呈紅色，膠原纖維呈藍色。與青年對照組比較，自然衰老組膠原纖維明顯增多(P< 0.05)，而TFE組腎臟組織中的膠原纖維較自然衰老組減少，且高劑量組效果顯著(P< 0.05)。

3.3 TEF對自然衰老大鼠腎臟組織SOD活力的影響

如圖3所示，與青年對照組相比，自然衰老組SOD活力顯著下降，而MDA的含量在自然衰老組大鼠腎臟組織中明顯上升(P< 0.05)，TFE組較自然衰老組SOD活力升高，MDA含量用藥后下降，且高劑量組有統計學意義(P< 0.05)。

3.4 TFE對自然衰老大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達的影響

如圖4所示，與青年對照組相比，自然衰老組TGF-β1、Smad3 mRNA表達明顯增加(P< 0.05)，而TFE組較自然衰老組顯著降低(P< 0.05)。

圖1 HE淫羊藿總黃酮對腎臟組織形態的影響(× 200)Fig.1 The effects of TFE on morphology of kidney slice of rats (× 200 )注：箭頭所示為炎性細胞浸潤。A：青年對照組；B：自然衰老組；C：淫羊藿總黃酮低劑量組；D：淫羊藿總黃酮高劑量組(下同)。Note:The arrows indicate inflammatory cell infiltration.A is the young contro groupl;B is the natural aging group;C is the low-dose group of TFE;D is the high-dose group of TFE (the same below).

圖2 淫羊藿總黃酮對腎臟組織膠原纖維沉積的影響Fig.2 The effects of TFE on collagenous fiber in kidney slice of rats s,n = 9-11 )注：與青年對照組比較，*P< 0.05；與自然衰老組比較，#P < 0.05(下同)。Note:Compared with young control group,*P< 0.05;Compared with natural aging group,#P < 0.05 (the same below).

3.5 TFE對自然衰老大鼠腎臟組織αSMA蛋白表達的影響

如圖5免疫熒光結果所示，與青年對照組相比，自然衰老組腎臟αSMA陽性表達明顯增加(棕黃色部分)(P< 0.05)，而經TFE給藥組較自然衰老組降低，且高劑量組效果更為顯著，具有統計學意義(P< 0.05)。

3.6 TFE對自然衰老大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad3蛋白表達的影響

如圖6所示，與青年對照組相比，自然衰老組TGF-β1、Smad3蛋白表達明顯增加，TFE組較自然衰老組明顯降低(P< 0.05)。

圖3 淫羊藿總黃酮對大鼠腎臟SOD活力和MDA含量的影響Fig.3 The effects of TFE on SOD vitality and the content of MDA in kidney of rats s,n = 9-11 )

圖4 淫羊藿總黃酮對腎臟組織中TGF-β1和Smad3的mRNA水平的影響Fig.4 The effects of TFE on the mRNA level of TGF-β1 and Smad3 in kidney s,n = 9-11)

圖5 淫羊藿總黃酮對腎臟組織中αSMA蛋白表達的影響 Fig.5 The effects of TFE on the protein expression of αSMA in kidney s,n = 9-11 )

4 討論

目前，我國老年人占總人口數的百分比已高達17%，老齡化是慢性腎臟疾病的主要因素之一，且老年患者并發癥的發生率也成倍增長，腎臟疾病的發生及發展將嚴重威脅到老年人口的生存時間和質量[12]。因此，探尋有效的干預措施,對慢性腎病患者的轉歸有一定的改善作用，而對于衰老過程而言，預防腎臟衰老可能是防治老年性腎臟疾病的途徑之一。

圖6 淫羊藿總黃酮對腎臟組織中TGF-β1/Smad3信號通路中蛋白表達的影響Fig.6 The effects of TFE on the protein expression of TGF-β1 and Smad3 in kidney s,n = 9-11 )

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多種慢性腎臟疾病發展到終末期的一種病理表現，也是衰老腎臟的主要表現之一和導致腎衰竭的主要原因之一[13]。腎小管上皮細胞表型轉分化是腎間質纖維化發生的核心環節，αSMA作為一種高度特異性的轉分化標記物，是纖維化發生的標記物之一[14]。通過HE染色和Masson染色可以觀察到，自然衰老大鼠腎臟組織中的膠原纖維明顯增多，免疫組化顯示αSMA表達量顯著升高，給予不同濃度淫羊藿總黃酮灌胃處理后，腎臟組織中膠原纖維含量減少，αSMA表達量下降，且高劑量組效果顯著，表明TFE能通過減少膠原纖維的產生而改善腎間質纖維化。

隨著年齡的增加，抗氧化能力逐步下降，機體自由基的產生和消除能力失衡，氧自由基不斷蓄積，導致細胞的損傷，功能下降[15,16]。SOD是一種抗氧化酶，以自由基為底物，與O2結合生成H2O2，是清除體內氧自由基的主要物質[17]。氧自由基通過誘發多不飽和脂肪酸的過氧化形成MDA等脂質過氧化物，引起細胞損傷。MDA含量可反映機體內脂質過氧化程度，與SOD共同反映抗氧化能力。本研究實驗結果顯示，與青年大鼠相比，自然衰老大鼠腎臟組織中SOD活力明顯下降，MDA含量升高，而給予淫羊藿總黃酮灌胃組的大鼠SOD活力較模型組增加，MDA含量下降。這說明衰老大鼠的抗氧化能力下降，而給予TFE灌胃后抗氧化能力較之提升。

伴隨著衰老的發生，機體代謝的代償能力逐漸衰弱，細胞受到代謝產物的刺激后活化，產生一系列炎性因子，從而誘導炎性細胞的產生和浸潤[18]。我們通過HE染色還可以觀察到，衰老大鼠腎臟組織中有廣泛炎性細胞浸潤，淫羊藿總黃酮處理組中的炎性浸潤明顯減少，說明淫羊藿總黃酮能通過減輕炎性細胞浸潤起到保護腎臟的作用。這與前期夏世金[19]、韓桂芳[20]等研究報道的淫羊藿總黃酮的抗炎作用相似。

TGF-β是一種強致腎小球硬化和腎纖維化的細胞因子[18]，其主要通過促進炎性細胞的募集和活化，介導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化以及促進細胞外機制的合成與沉積[21,22]。Smad蛋白是TGF-β受體的胞內激酶底物[23]，作為TGF-β信號的重要中介，它能夠通過TGF-β的早期靶基因的DNA結合特征域，直接激活編碼轉錄調控因子和信號轉導的基因。因此，TGF-β/Smad信號通路在慢性腎纖維化損傷進程中起著重要作用[23]。這說明找到針對TGF-β1這一靶點的有效藥物，有極大可能改善纖維化進展。在本項研究中，自然衰老大鼠腎臟組織中TGF-β1和Smad3的mRNA及蛋白水平均明顯升高，而給予TFE灌胃處理后降低，且高劑量效果顯著。這提示淫羊藿總黃酮可能通過抑制TGF-β1的表達，減少Smad3的表達，起到改善腎臟組織纖維化的作用。

綜上所述，TFE具有改善自然衰老SD大鼠腎臟纖維化的作用，其可能機制與降低自然衰老大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad3和αSMA的蛋白表達水平有關，以及通過減少炎性細胞浸潤、減輕氧化應激對腎臟造成的損傷，從而改善衰老腎臟纖維化。目前已有研究證實淫羊藿總黃酮在多部位臟器中具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，但尚未有研究報道其在腎臟組織中具有改善衰老所致的纖維化作用，而腎臟組織是機體代謝的重要參與者，因此，本研究具有一定的創新性和應用價值，為淫羊藿在衰老腎臟纖維化等相關一系列疾病的臨床防治中的應用提供了實驗基礎和應用依據。