長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中表達水平分析

鄒勇

摘要：目的：研究長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中的表達水平。方法：使用qRT-PCR檢測15例急性白血病和15例缺鐵性貧血患者的長鏈非編碼RNA CARLo 5的表達差異。結果：長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病與缺鐵性貧血患者中的表達存在差異。對比缺鐵性貧血對照組，長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病表達升高，有統計學意義。其中AML組的2-△CT值（x±S）為：0.3177±0.036，而對照組的2-△CT值（x±S）為：0.1041±0.0121 （ P<0.001）。 結論：長鏈非編碼RNA CARLo 5在急性髓性白血病中呈過表達狀態，可以作為急性髓性白血病的生物學標記。長鏈非編碼RNA CARLo 5有可能成為治療急性髓性白血病的藥物靶點。

關鍵詞：長鏈非編碼RNA，生物學標記，急性髓性白血病。

【中圖分類號】R733.7 【文獻標識碼】A?【文章編號】1673-9026（2021）02-010-02

急性髓性白血病（AML）是較常見的血液系統惡性疾病，目前，化療仍然是白血病治療中最重要和最基本的治療方法和手段，但是由于缺乏標靶的選擇性，在殺死腫瘤細胞時也會無選擇性的損傷正常的造血組織和細胞，往往在治療過程中產生比較大的副反應。能夠僅殺傷白血病細胞而對正常細胞無傷害的精準治療是我們夢想的治療方式，這就需要我們能找到白血病分子和正常分子之間的差異，針對差異去設計精準治療方案。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類轉錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。這類RNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具有生物學功能，無人關注，被塵封了起來。lncRNA能在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上調控基因表達，參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程[1-3]。而隨著高通量測序技術、大規模 LncRNA、 cDNA 文庫的建立 、基因芯片技術的高速發展，LncRNA被發現與生物進化、胚胎發育、物質代謝以及人類多種重大疾病關系密切，包括腫瘤發生、轉移等關鍵問題[4-7]。目前，LncRNA已經成為了腫瘤研究的前沿和熱點。

LncRNA CARLo 5（cancer-associated region long noncoding RNAs 5），是一種最近確認的長鏈非編碼RNA，位于染色體8q24，被認為在細胞周期和腸道腫瘤發展中有重要作用。LncRNA CARLo 5在腫瘤中發生，發展中有重要的意義，但LncRNA CARLo 5具體的作用機制及下游靶分子的研究尚不清楚，而且在白血病可中尚未見有LncRNA CARLo 5相關的基礎研究。

材料和方法

1.病例資料

收集 2016年 5 月-2018 年 5 月在福建醫科大學附屬漳州市醫院血液科確診 15 例初診的 AML 患者為研究對象（ AML 組），同期選擇性別與年齡相符，且符合缺鐵性貧血（ iron- deficiency anemia，IDA） 國際標準的 IDA 患者15 例作為對照組（ Control） 。所有入組者所留取的標本均為骨髓，所有入選者均簽署知情同意書。本研究經我院倫理委員會審核批準。

2.主要的試劑及儀器

RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司; 總 RNA 逆轉錄試劑盒購自美國 Thermofisher公司;熒光定量PCR（qRT-PCR）SYBR-Green 試劑盒購自日本 Takara 公司; 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ GAPDH） 和LncRNA CARLo 5 上下游引物購自上海生工生物工程股份有限公司，7500 熒光定量 PCR 儀：美國ABI 公司。

3.樣本收集、RNA 提取及逆轉錄

應用 EDTA抗凝管收集對照組、 AML組患者骨髓液 2 ml，用紅細胞裂解液裂解紅細胞后1 500 R / min 離心 5min，棄上清液后加入 1 ml TRizol充分吹打細胞沉淀，移至 1.5 ml EP 管中，標記保存于 -80 ℃。通過經典吸附柱法，按照說明書所述，抽提留存的骨髓標本中的總 RNA，紫外分光光度計檢測 RNA 濃度及純度。采用美國 Thermofisher 公司的逆轉錄試劑盒按其說明書步驟配置反應體系，在普通PCR 儀提前設置好的反應條件下將 RNA 逆轉錄cDNA，-20℃ 保存。

4.引物設計與合成

在美國國立生物技術信息中心（ National Center for Biotechnology Information，NCBI） （ https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/） 查找 LncRNA CARLo 5、 GAPDH基因序列，由上海生工生物工程公司設計并合成正反向引物，引物序列見表 1。

5.qRT-PCR

按照 SYBR Green試劑盒說明書操作，以 cDNA 為模板，反應體系為 20 μl，加入反應試劑進行 qPCR 反應。反應體系包括： 模板 cDNA 2 μl、SYBR 10 μl、GAPDH 或者 LncRNA CARLo 5 的正反向引物各 0.8 μl、加無菌蒸餾水至總反應體積 20 μl。qPCR 反應條件： 95 ℃ 、30s 預變性; 之后 95 ℃ 變性 5 s、60 ℃ 延伸 30 s，共計完成 45 個循環。每個樣品均設 2 個復孔PCR擴增結束后可獲取擴增循環數（cycle threshold CT）值，以 GAPDH為內參基因，采用2-△CT法計算LncRNA CARLo 5在實驗組和對照組中的表達。

6.統計學處理

采用 GraphPad Prism 6.01進行統計分析。采用 t 檢驗分析LncRNA CARLo 5表達量的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

LncRNA CARLo 5 在 AML 患者骨髓標本中的表達情況

qRT-PCR 法檢測LncRNA CARLo 5 在 15 例初治 AML 患者和15 例IDA 患者中的表達。結果顯示，LncRNA CARLo 5 在 AML 患者中的表達量較IDA（ Control） 患者明顯升高，有統計學意義。其中AML組的2-△CT值（x±S）為：0.3177±0.036，而對照組的2-△CT值（x±S）為：0.1041±0.0121，差異有統計學意義（P<0.001），見圖1。

討論

急性髓性白血病占據成人急性白血病的大部分，且多發于中老年人，因出現不耐受常規化療、無骨髓移植的情況，預后不佳，急待副作用較小的靶向治療。

Lnc RNA是一類長度大于 200 nts的RNA，在真核細胞內被廣泛被轉錄，曾被認為不具備生物學功能。但目前研究認為Lnc RNA具有非常重要的生物學功能，其雖然不翻譯，但也可以和蛋白分子一樣，作為調節分子參與調控細胞的增殖、周期、分化、凋亡等各種生物學過程，也參與腫瘤的發生、生長、浸潤、轉移及復發等各種病理過程。如LncRNA UCA1 通過調節CREB蛋白表達水平并激活 PI3K 信號通路參與膀胱癌細胞周期的調控，促進了腫瘤的生長，表明 lncRNA 與腫瘤異常信號通路有關[8] ;LncRNA CCAT1被c-myc基因激活促進了胃癌的增殖和遷移[9]，而LncRNA-HEIH通過抑制 EZH2 靶基因提高了EZH2 蛋白表達水平，促進肝癌細胞周期 G0/G1 期阻滯。越來越多的文章表明，相對正常組織，LncRNA在惡性腫瘤中有明顯異常的表達，它可以作為很多腫瘤的分子標記。

LncRNA CARLo 5是一種最近確認的長鏈非編碼RNA，位于染色體8q24，被認為在細胞周期和腸道腫瘤發展中有重要作用。原癌基因MYC增強子的rs6983267 allet能與LncRNA CARLo 5的啟動子的激活調節區域結合并長期作用，從而影響LncRNA CARLo 5的表達，而增加腫瘤的易感性[10]。Luo J[11]認為LncRNA CARLo 5是一個小細胞肺癌的陽性預后因子，和其致瘤性相關。而在肝癌研究的回顧性研究中，LncRNA CARLo 5也被認為和疾病進展和預后相關[12]。而在血液腫瘤中LncRNA CARLo 5的研究罕見報道。本研究表明，LncRNA CARLo 5 在AML 高表達，下一步可擴大病例數驗證上述結果，并研究LncRNA CARLo 5 的表達水平與 AML 患者總生存和預后的影響。同時在白血病細胞株中深入研究 LncRNA CARLo 5 在白血病中的作用及可能的機制。

參考文獻

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福建醫科大學附屬漳州市醫院血液科?363000