分子生物技術在川貝母鑒別中的應用展望

喻瑩 陳建偉 陳志禹

摘 要 川貝母是中國最常用的化痰止咳貴重藥草，貝母屬植物種類繁多，各種屬來源復雜，川貝母與其混偽品之間鑒別困難，近年來分子生物技術在川貝母鑒定中開始了大規模的應用研究，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、SSR、PCRISSR、qPCR、DNA條形碼、SNP、PCR-AFLP等技術的應用，并且展現出較好的應用前景。

關鍵詞 分子生物技術 川貝母 鑒別

中圖分類號：R282.5 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）05-0073-04

*基金項目：寧波市自然科學基金項目“realtime PCR用于檢定川貝母摻偽情況的定量研究”（2018A610429）

Prospect of the application of molecular biotechnology in identification of Fritillaria cirrhosa*

YU Ying1**， CHEN Jianwei2***， CHEN Zhiyu2

（1. Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310053， China； 2. Ningbo Institute for Drug Inspection， Zhejiang Ningbo 315000， China）

ABSTRACT Bulbus Fritillariae cirrhosae is phlegm cough precious herbs that is the most commonly used in China. There are many different kinds of plants of the genus Fritillaria and the sources of various genus are complex. The identification between Bulbus Fritillariae cirrhosae and the adulterants are difficult. Molecular biotechnology has begun a large-scale study in identification of Bulbus Fritillariae cirrhosae in recent years， such as PCR-RFLP， PCR-RAPD， SSR， PCR-ISSR， qPCR， DNA barcoding， SNP， PCR-AFLP and other technologies and shows a good application prospect.

KEY WORDS molecular biotechnology； Bulbus Fritillariae cirrhosae； identification

川貝母是百合科貝母屬多年生草本植物，有淸熱潤肺，化痰止咳，散結消癰的功能。我國的藥用貝母屬植物超過50種，中國藥典2015年版[1]共收錄5大類貝母：川貝母、平貝母、伊貝母、浙貝母和湖北貝母，其中川貝母基原植物有： 川貝母（F. cirrhosa D. Don）、暗紫貝母（F. unibracteata Hsiao et K. C. Hsia）、甘肅貝母（F. przewalskii Maxim）、梭砂貝母（F. delavayi Franch）、太白貝母 （F. taipaiensis P. Y. Li）或瓦布貝母（F. unibracteata Hsiaoet K. C. Hsia var. wabuensis）。由于需求量大而資源少，優質川貝母價格昂貴，市場上存在用其他低價的近緣品種（如小平貝和伊貝母）充當川貝母出售的現象。中國藥典2015年版規定的川貝母鑒別法主要有顯微鑒別法、薄層色譜法以及PCR-RFLP法。近年來分子生物技術的應用，使其鑒定手段從傳統形態表征擴展到了遺傳物質DNA：核糖體上的ITS保守區序列、葉綠體上的psbA-tmH序列等，可定量、準確地對川貝母進行鑒別。本文就分子生物技術在川貝母鑒別中的應用及展望作一簡單綜述。

1 PCR-RFLP技術

PCR-限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術是以PCR技術為基礎，擴增產物被限制性內切酶切割，產生不同長度的DNA條帶，可通過條帶灰度反應摻偽比例大小。早在2005年，Wang等[2]將RFLP技術應用于伊犁貝母的鑒別中，后逐漸應用于湖北貝母、平貝母、浙貝母、伊貝母等鑒別中，反應體系也逐漸優化。徐傳林等[3]對PCR-RFLP技術進行改進：采用DNA快速提取試劑盒提取DNA；PCR擴增（預變性4 min，變性30 s，復性30 s，延伸30 s，最終再延伸5 min；循環次數為30次）；酶切（時間為2 h；DNA酶為SmaⅠ限制酶）；且PCR擴增、電泳、酶切步驟中RSD均小于10%，證明反應穩定性高。此方法不同實驗室靈敏度可達50%以上[4]，適用范圍廣，結果穩定，技術較成熟，已被收錄于中國藥典2015年版川貝母鑒別項下。但藥典采用的PCR-RFLP法無法進行定量檢測，并且由于PCR法過于靈敏，摻入少量川貝母即可出現假陽性現象。趙仲麟等[5]的實驗表明真品川貝母擴增產物含有SamⅠ酶切位點，在100～250 bp之間存在明確的2條酶切條帶，而偽品中由于沒有SamⅠ酶切位點而不能被切出該片段。此外，還進行了相對定量分析研究，含量10%及以上的真品川貝母能被穩定檢測出。針對PCR-RFLP的貝母鑒別技術研究較多，相對其他分子鑒別技術，技術較成熟。

2 PCR-RAPD技術

PCR-隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，PCR-RAPD）標記技術是利用一系列（8～10個堿基）不同的隨機引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，通過凝膠電泳分離來檢測DNA片段多態性的技術。PCR-RAPD技術可以揭示高度的多態性，并且不需要設計引物，對模板DNA濃度要求較低。該方法簡單明了，適合在中醫藥行業中應用。Xin等[6]利用RAPD技術對貝母種質資源的一個0.65 kb的DNA分子標記進行了鑒定。根據RAPD擴增產物開發了代表序列特征擴增區域（SCAR）的DNA標記。將SCAR標記成功用于川貝母種間鑒別。SCAR標記具有大規模分析的優點，成本低，重復性高，且易于使用，對比PCRRFLP鑒別法，不需要高質量DNA，無需預備性工作，不需設計引物。

3 SSR篩選

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）標記，又稱微衛星標記，是一類由數個核苷酸為重復單位組成的重復序列。SSR篩選具體操作步驟包括：RNA提取及測序、SSR檢測、PCR擴增、電泳、結果分析。將篩選出的川貝母的SSR序列，作為特異性序列，與偽品進行鑒別。早些年的研究曾嘗試用通用分子標記來鑒別近源種貝母，但系統發育信號不足。張婕等[7]通過高通量測序在川貝母中檢測到3 817個SSR位點，SSR出現頻率為8.49%，平均每10.37 kb序列出現1個SSR位點，其中重復類型最多的為三核苷酸和二核苷酸，所占比分別為56.51%和27.06%，為川貝母的遺傳標記和指紋圖譜的開發提供了重要依據。

4 PCR-ISSR技術

PCR-內部簡單重復序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）是將錨定的微衛星DNA（即SSR序列的3端或5端加上2～4個隨機核苷酸）作為引物，對重復序列之間的區域進行PCR擴增的方法。此方法不需要測序及設計引物，與RAPD方法類似。詹羽姣等[8]采用ISSR技術對新疆貝母進行遺傳多樣性分析，其中多態性條帶為195條，占97.99%，遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）分別為74.74%和0.301 4 cm，同樣可將ISSR應用于川貝母的鑒別。ISSR還可與RAPD單獨或聯合應用于川貝母的遺傳關系分析。

5 qPCR技術

實時熒光定量PCR技術（realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）是以免疫學原理為基礎的一種新型技術。與其他不同的是，對目的基因擴增結果不是通過瓊脂糖凝膠電泳來判斷，而是通過熒光標記的特異性探針（通常為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光基團和一個淬滅基團），對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程，再計算Cq值，建立標準曲線，可以對樣本含量定量計算。此技術在川貝母研究中的應用較少，僅國內有數篇報道[9-12]。王成等[9]以TaqMan為探針，通過篩選、特異性測試、擴增條件優化和方法靈敏度測試，形成一套川貝母物種特異性實時熒光PCR方法。在此基礎上建立標準曲線，當引物終濃度1.2 μmol/L、探針終濃度0.6 μmol/L時，可檢測川貝母含量低至0.05%的樣品。qPCR的實驗結果可通過Cq值和擴增曲線圖來直觀表示，可以實時監測反應過程，且反應特異性強、操作簡單、用時少、準確率高，有很好的應用前景。表1將RFLP、RAPD、ISSR、qPCR之間進行了對比。

6 DNA條形碼

DNA條形碼（DNA barcode）是指生物體內能夠代表該物種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段。DNA條形碼技術以PCR-RFLP技術為基礎，將樣品經過DNA提取→引物設計→PCR擴增→電泳→序列測定→多重序列對比及聚類分析的步驟，將DNA條形碼與數據庫進行對比。其中序列分析是最重要的環節，首先進行序列比對和人工矯正，通過軟件計算種內和種間K2P距離，然后根據計算結果建立NJ樹，最后根據遺傳距離就能對樣本進行分類和鑒定。其中ITS2序列是近幾年的研究熱點，ITS2是rRNA基因非轉錄區的一部分，它的序列變化較大，具有重復率、特異性高的特點。但ITS2不能將川貝母篩選到“種”，也容易造成實驗污染。其他高效的DNA條形碼序列還包括葉綠體基因組的psbA-trnH，rbcL，matK，psbK-psbI，atpF-atpH等，可以將川貝母與其混偽品有效地區分，成為近幾年研究的熱點。DNA條形碼還可作為SSR、SNP等技術的實驗基礎，應用廣泛。Zhong等[13]將DNA條形碼技術與HPLC指紋圖譜相結合，先是應用DNA條形碼技術（ITS2具有最高的種間差異，種內距離為0.000 0～0.008 5 cm，種間距離為0.002 1～0.005 3 cm，平均距離為0.003 0 cm）識別出貝母屬，后通過HPLC指紋圖譜及主成分圖進行聚類分析，將川貝母與其他類貝母區分開，為川貝母質量控制和鑒定提供依據。DNA條形碼技術的準確率極高，且操作難度低，但DNA測序成本較高，且無法定量檢測出摻偽含量。

7 單核苷酸多態性（SNP）標記技術

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）主要是指在基因水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。可通過比對兩種或多種基因組全序列進行川貝母的鑒別。SNP標記技術不需要凝膠電泳，代之以DNA芯片技術，不再以DNA長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記。蘭青闊等[14]應用多重序列比對、 SNP 篩選等生物信息學分析手段，對貝母屬葉綠體基因組序列進行分析，貝母屬植物序列大小在151 009～152 224 bp之間，序列一致性為97.22%，共發現SNP位點5 879個，其中川貝母類鑒別候選位點71個。該技術兼有PCR技術的靈敏性和測序技術的準確性，精密度在10%左右，且一次可檢測96個樣本，操作簡單，與熒光信號結合還可定量檢測樣本含量，精密度在0.1%左右。但其價格昂貴，日常鑒別應用較困難。

8 PCR-AFLP技術

PCR-擴增片段長度多態性技術（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是用兩種酶切割出引物結合位點，后對酶切片段進行選擇性擴增。AFLP具有RFLP的高特異性和PCR的高效性，可重復性好。徐金中等[15]將AFLP應用于浙貝母的遺傳多樣性的分析，多態性條帶達67%以上，表明AFLP能檢測到很豐富的多態性，具有在川貝母鑒別中應用的可行性。AFLP結合了RFLP與RAPD的優點，不足之處是費用高，步驟繁瑣，反應條件要求高，應用于日常鑒別有一定困難，目前需要簡化引物的篩選及優化實驗條件。

9 小結與展望

分子生物技術是一種較為先進的技術，具有較高的特異性和靈敏度。此技術種類繁多，其中以分子中的DNA檢測為主，但DNA分子較少，往往不能被直接檢測到，但運用PCR技術，可以將提取到的DNA進行擴增，近年來以PCR為基礎的多種分子生物技術發展迅速，廣泛應用于川貝母及其他中藥材的鑒定之中。

目前PCR相關鑒別法前景較好，操作也正趨向簡易、成熟。PCR-RFLP及PCR-RAPD的相關研究較廣泛，技術較成熟，結果穩定可靠，但操作耗時耗力，最適反應條件及酶切體系等正在進一步完善；RAPD采用隨機引物，但穩定性及重復性低，提高實驗穩定性尤為重要；SSR序列廣泛分布于川貝母DNA中，但需要測序，實驗成本較高，可作為ISSR技術的實驗基礎，不適于平時鑒別工作；ISSR技術使用的是隨機引物，實驗成本較低，操作較簡易，且目前的已知序列充足，開發SSR序列難度并非十分困難，將其應用于川貝母研究前景應該很好；qPCR技術可對川貝母進行準確定量分析，且精確度極高，目前在川貝母方面的研究相對較少，對于此技術的實驗步驟及條件的確立研究意義重大且前景較好；DNA條形碼是準確性最高的技術之一，但目前的數據庫仍需進一步完善，且實驗成本高，無法定量測定，與HPLC等化學測定技術相結合或將成為研究熱點；SNP篩選可將分子鑒定具體到核苷酸，但實驗成本較高。這些方法都是以PCR技術為基礎的，對川貝母的鑒別也都意義重大，各實驗室可根據自己的實驗意義、經費、實驗條件等因素選擇適合自己的技術。

常用的RFLP、RAPD等方法無法滿足大量樣品的檢測，但AS-PCR（等位基因特異性PCR）采用特異性引物，可將具有共同引物的樣本同時進行多重PCR鑒別（在一個PCR反應中實現多個目標序列的同步擴增），具有高通量性，可同時檢測幾十甚至上百個樣本，對數據庫的建立意義較大；分子生物技術還可與質譜法、統計學、多元分析法等方法相結合，更加全面準確地鑒別出川貝母的混偽品。生物芯片、mRNA差異顯示技術等已被應用于其他中藥材的鑒別，如劉潤南等[16]運用底芯片法和蓋芯片法篩查雙黃連注射劑中的致敏性成分；黎潔文等[17]應用mRNA差異顯示技術篩選何首烏中二苯乙烯苷合成相關基因。但這些暫未應用于川貝母的鑒別，將此類方法進行優化，同樣有望應用于川貝母的真偽鑒別。目前川貝母鑒別方法雖多，但部分技術屬新型技術，研究不夠透徹，故完善已有技術及尋找新方法對川貝母的鑒別均有重大意義。

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