五子衍宗丸對化療性腸黏膜炎小鼠的保護作用及其機制研究*

周衛東 盧漢祺 陳澤偉 田春陽 孫曉敏 趙曉山 譚 為

目前對化療引起的腸黏膜炎治療手段有限，主要為止吐、抑酸、飲食干預，及谷氨酰胺、益生菌等對癥治療，但其預防或者治療胃腸道黏膜炎效果有限[1-4]。

5-HT3受體拮抗劑是臨床常用的止吐藥，有研究表明，雷莫司瓊對化療引起的胃腸道黏膜炎效果有較好的治療效果[5,6]，本研究擬采用5-FU誘導小鼠小腸炎模型，通過五子衍宗丸(WYP)與雷莫司瓊(RAM)療效效果進行比較，以探索WYP治療化療性腸道黏膜炎效果，并對其抗炎機制進行初步分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑枸杞子(寧夏，廣東健禾藥業有限公司，批號:110801)；鹽菟絲子(山東，廣東和翔制藥有限公司，批號:111101)；覆盆子(浙江，廣東三信藥業有限公司，批號:110901)；炒車前子(江西，廣東健禾藥業有限公司，批號:110901)；制五味子(產地：山西廣東天誠中藥飲片有限公司，批號111002)；5-FU(上海旭東海普藥業有限公司，批號：FA140518)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、ELISA試劑盒 ( R&D，美國)；Tunel試劑盒(Roche，瑞士)等。

1.1.2 實驗動物7周齡SPF級雄性BALB/c小鼠，體質量18～22 g(由廣東醫學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0002)。實驗前所有小鼠適應性喂養7 d，室溫22～26 ℃，相對濕度40%～60%，明暗交替12 h，自由飲水、采食。實驗動物室保持安靜，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 方法

1.2.1 五子衍宗丸的制備五子衍宗丸混懸劑的制備方法為：將枸杞子、鹽菟絲子、覆盆子、炒車前子烘干，取枸杞子40 g，鹽菟絲子40 g，覆盆子20 g，炒車前子10 g及制五味子5 g，混合，粉碎至過120篩目的粉末，充分拌勻，分別取1.5 g，0.76 g，0.38 g粉末，加入0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)20 ml制備成懸濁液，備用[7]。

1.2.2 分組和給藥方法小鼠隨機分為正常組、對照組、雷莫司瓊(RAM)組、五子衍宗丸高劑量(HWYP)組、五子衍宗丸中劑量(MWYP)組、五子衍宗丸低劑量(LWYP)組，每組10只。對照組、RAM組、HWYP組、MWYP組和LWYP組給予腹腔注射5-FU(mg·kg-1)，第1次給藥記為給藥第0天，每天上午8:00給藥，每天1次，連續給藥5次，正常給藥相應體積pH=7.4的PBS；HWYP組、MWYP組、LWYP組每次分別給予灌胃WYP 0.75 g·kg-1、0.38 g·kg-1、0.19 g·kg-1，RAM組給予灌胃RAM 0.1 g·kg-1，每天上午9:00給藥及下午17:00給藥各1次，從5-FU給藥前2天開始給藥，連續7 d，正常組和對照組給予灌胃相應體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.3 觀察指標

1.3.1 體質量情況給藥第0天開始測量體質量，體質量的改變通過體質量分數表示：體質量分數=第n天的體質量×100/第0天的體質量。

1.3.2 腹瀉給藥第0天開始觀察大便的情況。腹瀉癥狀評分：0分，正常；1分，微濕；2分，中等濕度；3分，松散便；4分，水樣便[4]。

1.3.3 組織學評價麻醉小鼠，打開腹腔，取新鮮的小鼠空腸組織，4 %多聚甲醛溶液固定24 h，行脫水、透明、浸蠟、包埋組織，病理切片用蘇木精-伊紅染色(HE)，鏡下觀察。通過測量的空腸絨毛長度、隱窩深度、空腸絨毛長度/隱窩深度比值來評價其形態學的改變。

1.3.4 炎癥因子蛋白含量的測定將空腸組織3 g，加4℃生理鹽水，使用勻漿器勻漿后，在低溫離心機 3000 r/min 離心15 min，取上清液。含量測定方法嚴格按TNF-α、IL-6和 IL-1β試劑盒說明書操作。

1.3.5 凋亡指數分析按TUNEL試劑盒說明書方法操作：取石蠟切片脫蠟至水、修復、破膜、加試劑1(TdT)與試劑2(dUTP)、阻斷內源性過氧化物酶、加試劑3、DAB顯色、復染細胞核、脫水封片。Image pro-plus 6.0軟件分析熒光tunel凋亡圖片方法：每組內每張切片從掃描結果上在相同倍數下進行采圖，應用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張照片進行分析得出每張照片陽性細胞的比率(陽性細胞數/總細胞數)即為細胞凋亡率。

2 結果

2.1 小鼠體質量變化給藥第1天起，對照組小鼠體質量百分比相對正常組出現顯著下降；給藥后第3天，MWYP組體質量百分比較對照組明顯更高(P<0.05)；而到第5天，HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組比對照組體質量均明顯更高(P<0.05或P<0.01)；MWYP組比LWYP組體質量百分比明顯更高(P<0.05)。見圖1。

2.2 小鼠大便得分情況各5-FU模型組小鼠大便從干便、濕便，再到水樣便。注射5-FU第1天后，對照組大便得分與正常組相比得分明顯升高(P<0.01)；給藥第5天，HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組得分顯著低于對照組(P<0.05或P<0.01)，MWYP組得分顯著低于LWYP組(P<0.05)。大便得分變化見圖2。

注：與正常組比較，**P<0.01；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01, 與LWYP組比較，圖1 五子衍宗丸對化療小鼠體質量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與對照組比較，圖2 五子衍宗丸對化療小鼠腹瀉的影響

2.3 五子衍宗丸對化療小鼠黏膜形態學的影響正常組小腸絨毛形態整齊規則，而對照組絨毛形態萎縮、缺失，損傷較嚴重。見圖3。與正常相比，對照組空腸絨毛高度值顯著減少、隱窩深度顯著增加、空腸絨毛高度值/隱窩深度值減少(P<0.01)。與對照組相比，HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組空腸絨毛高度值顯著增加、隱窩深度值顯著減少、空腸絨毛高度值/隱窩深度比值增加(P<0.01)。MWYP組的WYP比LWYP組的WYP絨毛高度值顯著增加、隱窩深度值顯著減少、空腸絨毛高度值/隱窩深度比值增加(P<0.05或P<0.01)。與RAM組相比，HWYP組、MWYP組小鼠空腸隱窩深度更小，絨毛高度/隱窩深度比值更大(P<0.05)。見圖4。

注：A：正常組；B：對照組；C：RAM組；D：HWYP組；E：MWYP組；F:LWYP組(HE, ×200)圖3 各組小鼠空腸的HE染色切片圖

2.4 五子衍宗丸對化療小鼠腸道炎癥因子的影響與正常組相比，對照組、HWYP組、MWYP組、LWYP組、RAM組小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平更高(P<0.01)。與對照組或LWYP組相比，RAM組、HWYP組、MWYP組小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平更高或含量水平更低(P<0.05或P<0.01)。見圖5。

2.5 五子衍宗丸對化療小鼠腸道細胞凋亡的影響給藥后1 d，正常組凋亡細胞稀少，對照組可見大量的凋亡細胞，MWYP組較對照組凋亡細胞較少。見圖6。給藥后1 d(24 h)或第3天，與正常組相比，對照組、MWYP組的凋亡率顯著升高(P<0.01)；與對照組比， MWYP組凋亡率顯著降低(P<0.01)。與對照組給藥第1天比較，對照組給藥第3天細胞凋亡率明顯減少。見圖7。

3 討論

化療相關性腸道黏膜炎在中醫屬于“泄瀉”“下利”范疇。腎陽虛是中醫辨證最常見的證型之一[8]。腎陽虛型泄瀉病機為陽氣不足，命門火衰，不能助脾腐熟水谷，水谷不化而為泄瀉。五子衍宗丸為補腎名方，具有補腎益精、溫補腎陽的功效。本研究通過給小鼠使用化療藥物(5-FU)的同時，使用五子衍宗丸溫補腎陽，緩解化療藥物對腎陽的損傷，從而證明化療過程中預防腸道黏膜炎補腎的重要性。

注：與正常組比較，**P<0.01；與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與RAM組比較，aP<0.05；與LWYP組比較，圖4 WYP對5-FU引起的小鼠小腸黏膜形態學的影響

注：與PBS+蒸餾水組比較，**P<0.01；與5-FU+蒸餾水組比較，#P<0.05，##P<0.01；與LWYP組比較，圖5 WYP對炎癥因子蛋白水平的影響

注：A:正常組；B:對照組；C:MWYP組圖6 五子衍宗丸對化療小鼠腸道細胞凋亡的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與對照組比較，##P<0.05，與對照組給藥第1天比較，圖7 五子衍宗丸對化療小鼠腸道細胞凋亡的影響

從本研究結果來看，對照組因使用5-FU后，小鼠體質量一直出現顯著下降。RAM、高中劑量的WYP能顯著改善小鼠的腹瀉和體質量下降情況，而中劑量的WYP效果明顯好于低劑量的WYP，提示WYP改善5-FU 引起的小鼠體質量下降、腹瀉癥狀存在一定量效關系；在病理形態學上，對照組小鼠腸黏膜嚴重損害：絨毛形態萎縮變短、切片外觀上絨毛形態萎縮、 缺失。與對照組相比，3組WYP組、RAM組都能夠顯著性抑制5-FU引起的空腸絨毛萎縮變短、隱窩深度增加、絨毛長度/隱窩深度比下降，且HWYP組、MWYP組抑制隱窩深度增加的效果明顯好于RAM組，說明WYP 能改善 5-FU對絨毛和隱窩的損害，高中劑量的WYP對隱窩細胞的保護效果明顯好于RAM。

有研究表明：炎癥因子(如TNF-α、IL-1β)對腸道黏膜損傷的嚴重程度和修復過程起著重要的影響[9,10]。TNF-α是出現較早、較重要的促炎癥因子，促使其它炎癥因子(如IL-6、IL-1、IL-8等)的產生[7,8]。IL-6通過IL-6/STAT3信號途徑促使T細胞抗凋亡，由于T細胞對抗凋亡而累積的循環作用導致慢性炎癥[11]。IL-1β在化療性黏膜炎的發生也起著關鍵作用[12]。 通過對炎癥細胞因子的合成與釋放的抑制，可以減輕組織損傷，屬于機體針對化療性腸炎的一種保護作用機制[13,14]。

本實驗結果表明，對照組的空腸組織中 TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著性升高，提示5-FU可能通過促進 TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細胞因子水平上升，誘導黏膜炎發生；而 WYP 能顯著性降低其 TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細胞因子水平升高現象，說明WYP可能通過抑制腸黏膜炎中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥細胞因子水平發揮治療作用，其抑制作用有一定的量效關系。高、中劑量的WYP組炎癥細胞因子水平與RAM組無顯著意義，其抑制促炎抗炎因子作用與RAM相當。因此，WYP可能抑制腸道組織中的IL-6、TNF-α、IL-1β水平，減輕炎癥反應；通過減輕炎癥反應，以保護對絨毛、隱窩的損傷，從而改善體質量下降、腹瀉的小腸黏膜炎癥狀。

目前認為腸道黏膜上皮細胞凋亡在化療性腸道黏膜炎的發病中占有極其重要的地位，抑制黏膜的上皮細胞凋亡可能是控制炎癥性腸炎發生及發展的主要原因之一[15]。從本研究來看，5-FU導致腸道細胞加速凋亡，給藥第1天凋亡細胞數量的增加明顯超過給藥第3天，這可能說明凋亡主要在24 h內引發，且是腸道黏膜炎發展的關鍵點。與對照組相比，MWYP組凋亡細胞明顯減少，說明WYP都能夠顯著性抑制5-FU引起的細胞凋亡。因此，WYP抑制腸黏膜的細胞凋亡可能是治療化療性腸炎發生及發展的主要原因之一。

化療對小腸細胞凋亡與促炎因子密切相關的(如TNF-α，IL-1β，IL-6)[16]，有研究表明，TNF-α通過TNF-α-TNFR信號通路參與CWP通過激活FAS-caspase-8的發生和發展，從而抑制自噬而促進細胞凋亡[17]。IL-6通過傳導信號誘導STAT3磷酸化，而STAT3自身則誘導抗凋亡因子bcl-xl和 bcl-2，由此誘導T細胞抗凋亡[18]。IL-1β可誘導細胞Bax等促凋亡蛋白的表達，活化caspase-3、caspase-9導致細胞發生內源性細胞凋亡[16]。

WYP能夠抑制小鼠空腸TNF-α、IL-1β、IL-6含量水平，抑制腸道細胞的凋亡。鑒于炎癥因子與凋亡存在一定的相關性，我們推測WYP治療化療性腸炎的抗炎機制可能通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6水平達到抗細胞凋亡的作用，對腸道的上皮細胞凋亡的抑制進而控制炎癥性腸炎發生及發展。盡管如此，其細胞凋亡的信號通路不明，更深層次的機制仍有待進一步研究。