長鏈非編碼RNA DDX11-AS1對肝癌細胞增殖、侵襲能力的影響及其機制

羊丹，徐菁，陳保銀，馬竹芳

三二〇一醫院，陜西漢中723000

肝細胞癌（HCC）是肝臟腫瘤最常見的類型［1-2］。現有的治療方法對晚期HCC患者的療效有限［3］。增殖和轉移被認為是惡性腫瘤兩個最重要的生物學特征，是腫瘤進展的重要原因［4］。研究HCC 進展相關機制將有助于進一步探索新的治療靶點。長鏈非編碼RNA（lncRNA）已被證明與HCC 的進展有關，隨著高通量測序等技術的發展，越來越多新的lncRNA被發現［5］。DEAD/DEAH 盒解旋酶11 反義RNA1（DDX11-AS1）是與腫瘤密切相關的lncRNA之一，在胃癌、食管癌和骨肉瘤等多種腫瘤中高表達［6-8］。SHI 等［9］研究發現，DDX11-AS1 在HCC 中表達上調，與患者預后不良相關，可能是HCC 治療的潛在靶點。但DDX11-AS1是否與HCC的增殖和侵襲相關，目前仍不明確。2018 年8 月—2020 年1 月，本研究觀察了DDX11-AS1對HCC細胞增殖和侵襲的影響，并探討可能機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人HCC 細胞HepG2、Huh-7、SK-hep-1 及正常肝細胞LO2 購自中國科學院。DMEM 高糖培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司。TRIzol 試劑購自日本TaKaRa 公司。ULtraRT一步法RT-PCR 試劑盒購自北京百奧萊博公司。DDX11-AS1 siRNA 購自廣州銳博生物生物技術有限公司。MTS 試劑購自美國Biovision 公司。Tran?swell小室購自美國Coring公司。蛋白裂解液和蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。PI3K、pPI3K、AKT、pAKT 和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司。PI3K/AKT 信號通路激活劑SC79購自皓元生物技術有限公司。

1.2 不同HCC 細胞DDX11-AS1 檢測 將HepG2、Huh-7、SK-hep-1 及LO2 細胞接種于含10% 胎牛血清的基礎培養基中，于37 ℃、5% CO2全濕培養箱中培養。細胞長滿時棄掉培養基，PBS 洗3 次，加入TRIzol 試劑，完全裂解細胞，并依次加入氯仿、異丙醇和無水乙醇離心后獲取細胞中總RNA。按照RTPCR 試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，并繼續進行擴增。PCR 反應體系包括2×ULtraRT one step Buffer 25 μL、ULtraRT one step EnzymeMix 1 μL、上下游引物各2 μL、RNA 1 μL，用無RNA 酶的雙蒸水補足50 μL。反應條件：逆轉錄45 ℃30 min，PCR 預變性95 ℃5 s，變性94 ℃5 s，退火65 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，變性、退火、延伸共40 個循環。以2-??Ct計算DDX11-AS1 相對表達量。DDX11-AS1 上游引物序列為5"-TTAGGAGGACAACGAATCACCTC-3"，下游引物序列為5"-GTCATCTCCCAGAACCAGACTTT-3"。內參GAPDH 上游引物序列為5"-TGAAGGTCG?GAGTCAACGGATTT-3"，下游引物序列為5"-GCCATG?GAATTTGCCATGGGTGG-3"。

1.3 干擾DDX11-AS1 表達對HCC 細胞增殖、侵襲能力的影響觀察

1.3.1 細胞分組及轉染 取“1.2”中DDX11-AS1表達水平相對較高的HCC 細胞，以1.0×105/孔鋪至6孔板中，培養至細胞貼壁。將HCC細胞分為對照組和實驗組，分別轉染NC siRNA和DDX11-AS1 siRNA，于培養箱中繼續培養。轉染48 h后，采用qRT-PCR法測得對照組、實驗組細胞中DDX11-AS1 相對表達量分別為1.02 ± 0.04、0.35 ± 0.08，提示DDX11-AS1 siRNA可以抑制HCC細胞中DDX11-AS1的表達。

1.3.2 細胞增殖能力觀察 細胞增殖率測算：收集兩組細胞，以2×103/孔接種于96孔板中，每組設置5個復孔，放置培養箱中培養；48 h后每孔更換培養基100 μL，并加入MTS 試劑20 μL，在培養箱中孵育2 h，酶標儀檢測各孔490 nm 處的光密度（OD）值；以實驗組OD 值/對照組OD 值×100% 計算細胞增殖率。細胞克隆形成率測算：收集兩組細胞，以2×103/孔接種于6 孔板中，每組設置3 個復孔，在培養箱中培養，每隔2 d 更換1 次新鮮培養基；待肉眼可見的細胞克隆團形成時終止細胞培養，PBS 洗3 次，甲醇溶液固定10 min，吉姆薩染色，干燥后計數細胞克隆團；以實驗組克隆團數/對照組克隆團數×100% 計算細胞克隆形成率。

1.3.3 細胞侵襲能力觀察 收集兩組細胞，以無血清培養基洗3 次，制備為1×106/mL 的無血清細胞重懸液，每組設置3 個復孔。取細胞重懸液100 μL 加至Transwell 小室的上室膜上，含10% 胎牛血清的培養 基500 μL 加 至Transwell 小 室 的 下 室 中，并 將Transwell小室放入下室中。放置細胞培養箱中培養10 h 后終止培養，PBS 將未穿膜的細胞洗去，甲醇溶液固定10 min，吉姆薩染色，顯微鏡下計數穿膜細胞數表示細胞侵襲能力。

1.3.4 細胞中PI3K/AKT 信號通路蛋白檢測 收集兩組細胞，加入RIPA 蛋白裂解液，冰上震蕩裂解30 min。4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，去除細胞碎片，獲得細胞總蛋白。檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性，80 V 電壓下行蛋白電泳分離2 h，于350 mA將蛋白轉至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶常溫孵育1 h。加入PI3K、pPI3K、AKT、pAKT 和GAPDH 一抗4 ℃孵育過夜，加入兔二抗室溫孵育2 h。TBST洗3次后，采用ECL 超敏化學發光曝光條帶，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.4 SC79對DDX11-AS1作用的干預觀察

1.4.1 HCC 細胞分組及處理 將HCC 細胞分為NC 組、si-DDX11-AS1 組 和SC79 組，NC 組轉染NC siRNA，si-DDX11-AS1 組 和si-DDX11-AS1+SC79 組轉染DDX11-AS1 siRNA。SC79組細胞加入5 μmol/L的SC79 10 μL，NC 組 和si-DDX11-AS1 組 加 入DMSO 10 μL，作用48 h后進行后續實驗。

1.4.2 細胞增殖能力觀察 收集三組細胞，采用MTS法檢測各組細胞增殖能力。方法參照“1.3.2”。

1.4.3 細胞侵襲能力觀察 收集三組細胞，采用Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力。 方法參照“1.3.3”。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC 細胞中DDX11-AS1 表達變化 HepG2、Huh-7、SK-hep-1、LO2 細胞中DDX11-AS1 相對表達量分別為7.28 ± 0.78、3.55 ± 0.54、5.08 ± 0.12、1.00 ± 0.02，HepG2、Huh-7、SK-hep-1 細 胞 中DDX11-AS1 表達高 于LO2 細 胞，其中HepG2 細胞DDX11-AS1表達量最高（P均＜0.05）。

2.2 干擾DDX11-AS1 表達對HCC 細胞增殖、侵襲能力的影響 實驗組細胞增殖率、克隆形成率、穿膜細胞數及細胞中pPI3K、pAKT 蛋白表達均低于對照組（P均＜0.05）。見表1、表2。

2.3 SC79 激 活PI3K/AKT 通路 對si-DDX11-AS1 組HCC 細胞增殖、轉移能力的影響 SC79 組、si-DDX11-AS1 組細胞增殖率和穿膜細胞數低于NC組，SC79 組細胞增殖率和穿膜細胞數高于si-DDX11-AS1組（P均＜0.05）。見表3。

表1 實驗組與對照組細胞增殖、侵襲能力指標比較（）

表1 實驗組與對照組細胞增殖、侵襲能力指標比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實驗組對照組穿膜細胞數（個）47.33 ± 7.02*102.67 ± 11.02細胞增殖率（%）67.33 ± 5.99*100.00 ± 2.00克隆形成率（%）33.87 ± 3.01*100.00 ± 1.00

表2 實驗組與對照組細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達比較（）

表2 實驗組與對照組細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別實驗組對照組pAKT 0.06 ± 0.04*0.50 ± 0.10 PI3K 0.81 ± 0.17 0.86 ± 0.09 pPI3K 0.11 ± 0.07*0.41 ± 0.11 AKT 0.56 ± 0.13 0.53 ± 0.09

表3 SC79組、si-DDX11-AS1組、NC組細胞增殖、侵襲能力指標比較（）

表3 SC79組、si-DDX11-AS1組、NC組細胞增殖、侵襲能力指標比較（）

注：與NC組相比，*P＜0.05；與si-DDX11-AS1組相比，#P＜0.05。

組別SC79組si-DDX11-AS1組NC組穿膜細胞數（個）72.67 ± 7.51*#39.33 ± 15.01*112.33 ± 19.08細胞增殖率（%）76.20 ± 5.92*#60.21 ± 8.06*100.00 ± 5.00

3 討論

HCC 是病死率很高的消化系統惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢［1］。肝切除、肝移植、局部消融治療和經動脈化學栓塞等療法廣泛用于HCC 的治療［10］，但HCC 的惡性程度較高，常復發和轉移，導致HCC 患者的預后較差［3］。HCC 的發病機制很復雜，涉及多種因素，包括乙型或丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素等暴露、飲酒過量、遺傳和表觀遺傳學等改變［11-12］，確切的發病機制仍不明確。深入研究HCC發生發展的分子機制，對于開發有效治療干預措施、改善HCC患者預后至關重要。

lncRNA 是一種長度超過200 個核苷酸的RNA，由于其缺少完整的開放閱讀框，不具有編碼蛋白質的功能［13］。lncRNA 參與人體多個生理過程的調節，其表達失調與腫瘤的發生和發展有關，這使得ln?cRNA 有望成為惡性腫瘤診斷和治療的靶點［14］。DDX11-AS1 是DDX11 的反義RNA，DDX11 是一種DNA 依賴性的ATPase 和解旋酶，參與DNA 復制和姐妹染色單體的內聚，而DDX11-AS1 可以調節DDX11 的活性，因此DDX11-AS1 是DNA 復制和細胞周期進程所必需的［15］。研究發現，DDX11-AS1 的異常表達可導致腫瘤的惡性進展。SHI 等［9］采用生物學信息分析技術發現HCC 組織中DDX11-AS1 高表達，并預示較差的預后，與HCC 惡性進展相關。本研究首先檢測了DDX11-AS1 在HCC 細胞中的表達 情 況，發 現HepG2、Huh-7、SK-hep-1 細 胞 中DDX11-AS1 表達均高于正常肝細胞，與大數據分析的結果一致［9］。選擇DDX11-AS1 表達相對較高的HepG2 細胞轉染DDX11-AS1 siRNA，檢測結果發現，抑制DDX11-AS1 表達后，HCC 細胞的增殖能力和轉移能力均降低，與膀胱癌和結直腸癌等腫瘤中DDX11-AS1 表達的相關研究結果一致［16-17］。這表明DDX11-AS1表達上調可促進HCC的惡性進展。

現已證實DDX11-AS1 可以被癌基因MYC 激活，同時被抑癌基因p53負調控，參與腫瘤的發生發展［14］。FENG 等［18］報道，DDX11-AS1通過激活PI3K/AKT 信號通路促進非小細胞肺癌的進展。PI3K/AKT 信號通路對細胞分化、增殖、凋亡等均具有重要的調控作用，且PI3K/AKT 信號通路與HCC 發病關系密切。PI3K 是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，其磷酸化水平的提高與腫瘤的發生發展有關。而其下游信號分子AKT 在HCC 中處于激活狀態［19］。抑制PI3K/AKT 信號通路激活，腫瘤的增殖和轉移受到抑制，因此PI3K/AKT 信號通路被認為是抗腫瘤治療的有效靶點。本研究發現，抑制DDX11-AS1 表達后，HCC 細胞中pPI3K 和pAKT 蛋白表達降低，表示PI3K/AKT 信號通路的激活受到抑制。 SC79 是PI3K/AKT 信號通路激活劑，可以增加PI3K 磷酸化水平。為了進一步研究DDX11-AS1是否通過PI3K/AKT 信號通路促進HCC 細胞的增殖和侵襲能力，我們以SC79 處理DDX11-AS1 表達受到抑制的HCC 細胞，觀察結果顯示，SC79 可以使因DDX11-AS1 表達降低而導致增殖、侵襲能力受抑制的HCC 細胞的惡性生物學行為得到部分恢復，提示DDX11-AS1 可能通過激活PI3K/AKT 信號通路促進HCC 的惡性進展。

綜上所述，HCC 細胞中DDX11-AS1 表達上調；干擾DDX11-AS1 表達可抑制HCC 細胞的增殖和侵襲能力，其機制可能與調控PI3K/AKT 信號通路有關。DDX11-AS1有望成為抗HCC治療的新靶點。