基于生物鐘基因的胃癌預(yù)后風(fēng)險評估模型的建立

金悅，盧文卿，包博文，鄭雪瑩，佟笛，車曉芳

1 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001；2 遼寧省腫瘤藥物與生物治療重點實驗室；3 遼寧省惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率、病死率高［1］，多數(shù)患者確診時已為晚期，預(yù)后較差［2］。因此，構(gòu)建準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測模型對于評估胃癌患者預(yù)后、篩選預(yù)后不良的高危人群以盡早治療、提高生存率具有重要意義。晝夜節(jié)律是生命體以24 h 為周期的活動［3-4］，晝夜節(jié)律的產(chǎn)生是由多種生物鐘基因所調(diào)控的，包括CLOCK、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、TIMELESS、BMAL1、DEC1、DEC2、NPAS2和RORA 等。這些生物鐘基因在不同惡性腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。生物鐘基因在胃癌中的研究較少，且大部分研究僅探索了生物鐘基因表達與胃癌的關(guān)系，對于多種生物鐘基因如何影響胃癌預(yù)后尚不明確。同時，因未綜合考慮所有生物鐘基因在胃癌中的作用，不能準(zhǔn)確反映生物鐘基因?qū)ξ赴╊A(yù)后的影響［5］。因此，深入探討生物鐘基因與胃癌預(yù)后的關(guān)系、構(gòu)建基于生物鐘基因的風(fēng)險評估模型，對篩選高?；颊?、提高胃癌患者生存率具有重要意義。2019 年6 月—2020 年9 月，本研究利用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中GES62254 數(shù)據(jù)集，分析上述12種主要的生物鐘基因?qū)ξ赴┗颊哳A(yù)后的影響，Cox 回歸分析篩選出生物鐘基因中影響胃癌患者生存的獨立預(yù)后因素，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，構(gòu)建了預(yù)測胃癌預(yù)后的風(fēng)險評分模型，為實現(xiàn)胃癌的精準(zhǔn)評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料來源 從NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.gov/geo/）下載GSE62254 數(shù)據(jù)集。排除缺失臨床病理資料的樣本，篩選出298例胃癌患者樣本。

1.2 不同生物鐘基因表達胃癌患者生存分析 根據(jù)298 例 胃 癌 患 者CLOCK、PER1、PER2、PER3、CRY1、CRY2、TIMELESS、BMAL1、DEC1、DEC2、NPAS2 和RORA 的表達情況，按照最佳cut-off 值分為高表達組和低表達組。采用Kaplan-Meier 法分析不同生物鐘基因高表達組和低表達組患者的總生存期（OS）。

1.3 影響胃癌患者生存時間的關(guān)鍵生物鐘基因篩選 采用Cox 單因素分析和多因素回歸分析篩選胃癌預(yù)后的獨立影響因素，將屬于獨立影響因素的生物鐘基因作為關(guān)鍵生物鐘基因。

1.4 關(guān)鍵生物鐘基因與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析 采用χ2檢驗分析關(guān)鍵生物鐘基因與胃癌患者年齡、性別、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期、腹膜轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.5 基于生物鐘基因的胃癌預(yù)后風(fēng)險評估模型的建立與驗證 建立胃癌預(yù)后風(fēng)險（RS）評分公式RS=β1X1+β2X2+…+βnXn，其中β 為偏回歸系數(shù)，X 為獨立預(yù)后因素的賦值。繪制RS 評分預(yù)測胃癌預(yù)后的ROC 曲線，計算曲線下面積和約登指數(shù)最大時的敏感度和特異度。

2 結(jié)果

2.1 不同生物鐘基因表達胃癌患者生存分析結(jié)果 CLOCK、PER1、PER3、CRY2、NPAS2、RORA 高表達的胃癌患者OS 短于低表達者（P均＜0.05），TIMELESS 高表達者OS 長于低表達者（P=0.012）。PER2、CRY1、BMAL1、DEC1、DEC2 表達與胃癌患者OS無關(guān)（P均＞0.05）。詳見表1。

2.2 影響胃癌患者OS 的關(guān)鍵生物鐘基因 Cox 單因素分析顯示，CLOCK、PER1、PER3、CRY2、TIME?LESS、NPAS2和RORA是影響胃癌患者OS的因素（P均＜0.05）。將以上7 個因素納入Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示PER1、CRY2和RORA是胃癌患者OS的獨立危險因素（P均＜0.05）。PER1、CRY2 和RORA 是影響胃癌患者OS的關(guān)鍵生物鐘基因。詳見表2。

表1 不同生物鐘基因高表達者和低表達者OS比較（月，）

表1 不同生物鐘基因高表達者和低表達者OS比較（月，）

注：與低表達者相比，*P＜0.05。

組別高表達者低表達者CLOCK 48.99 ± 2.65*51.97 ± 2.51 PER1 41.67 ± 2.46*59.76 ± 2.49 PER2 50.11 ± 2.16 51.24 ± 3.39 PER3 45.37 ± 2.70*54.52 ± 2.43 CRY1 49.07 ± 2.91 51.30 ± 2.34 CRY2 43.33 ± 2.49*59.21 ± 2.49組別高表達者低表達者RORA 43.44 ± 2.59*57.50 ± 2.44 TIMELESS 53.10 ± 2.42*47.83 ± 2.72 BMAL1 49.74 ± 3.16 50.86 ± 2.23 DEC1 51.74 ± 2.56 49.23 ± 2.60 DEC2 52.51 ± 2.59 48.43 ± 2.57 NPAS2 45.96 ± 2.65*54.98 ± 2.47

表2 影響胃癌患者OS的生物鐘基因分析結(jié)果

2.3 關(guān)鍵生物鐘基因表達與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 PER1 高表達與低齡（＜65 歲）、浸潤深度較深（T3～4）、TNM 分期較晚（Ⅲ+Ⅳ期）、腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。CRY2 高表達與浸潤深度較深、TNM分期較晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。RORA 高表達與低齡、浸潤深度較深、TNM 分期較晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。見表3。

表3 PER1、CRY2、RORA表達與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性（例）

2.4 基于生物鐘基因的RS評估模型應(yīng)用效能 利用Cox 單因素回歸分析性別、年齡、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)及PER1、CRY2、RORA 表達對胃癌患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，浸潤深度深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和PER1、CRY2、RORA 高表達是影響胃癌預(yù)后的危險因素（P均＜0.05）。Cox 多因素回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移和PER1 高表達是影響胃癌預(yù)后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表4。根據(jù)公式RS=0.692×淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移+0.747×遠端轉(zhuǎn)移+1.013×腹膜轉(zhuǎn)移+0.638×PER1 表 達 建 立RS 評 估 模 型。 計 算GSE62254 數(shù)據(jù)集中298 例樣本的RS 評分，根據(jù)RS 評分中位數(shù)分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，進行Kaplan-Meier 生存分析，結(jié)果顯示，高風(fēng)險組胃癌患者的OS 短于低風(fēng)險組［分別為（31.38 ± 2.48）、（62.63 ± 2.09）月］。繪制RS 評分預(yù)測胃癌預(yù)后的ROC 曲線，ROC 曲線下面積為0.817，約登指數(shù)最大時RS 評分的敏感度為0.642、特異度為0.899（圖1）。

表4 胃癌患者預(yù)后影響因素的單因素和多因素回歸分析結(jié)果

圖1 RS評分預(yù)測胃癌預(yù)后的ROC曲線

3 討論

本研究利用NCBI 中GSE62254 數(shù)據(jù)集分析12種生物鐘基因?qū)ξ赴╊A(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)PER1、CRY2、RORA 是生物鐘基因中影響胃癌預(yù)后的獨立危險因素；構(gòu)建的包含PER1 表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的風(fēng)險評估模型對胃癌預(yù)后具有較好的預(yù)測效能。

哺乳動物的生物鐘基因廣泛分布于多種組織和器官中，通過形成轉(zhuǎn)錄和翻譯反饋環(huán)來調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。CLOCK 與BMAL1 形成異二聚體，作為轉(zhuǎn)錄因子激活PERs、CRYs 和RORA 等，從而形成正反饋環(huán)；與此同時，PERs 和CRYs 形成寡聚體，通過結(jié)合CLOCK/BMAL1 抑制CLOCK/BMAL1 轉(zhuǎn)錄，形成負反饋環(huán)，調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律［6-9］。越來越多的研究證明，生物鐘基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用［10-11］。有研究顯示，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中PER1、PER2、PER3 及CRY2 低表達，而CLOCK、TIMELESS 高表達，且隨著TNM 分期增加，CRY1 表達逐漸降低［12］。還有研究發(fā)現(xiàn)，過表達PER2 能夠通過激活自噬通路抑制食管癌進展［13］；BMAL1 可通過上調(diào)MMP9 表達促進乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移［14］。因此，探究多種生物鐘基因在腫瘤中的作用有重要意義。本研究Cox 單因素和多因素分析結(jié)果顯示，PER1、CRY2和RORA 是影響胃癌預(yù)后的獨立危險因素。DING 等［15］研究顯示，PER1 在胃癌組織中高表達且PER1 高表達的患者OS 較短，這與本研究結(jié)果一致。關(guān)于CRY2 和RORA 在胃癌中的作用及對預(yù)后的影響目前尚不明確，仍需擴大樣本進行驗證。在此基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用以上三種生物鐘基因聯(lián)合臨床病理參數(shù)進一步篩選胃癌的獨立預(yù)后因素，創(chuàng)新性地建立了PER1 聯(lián)合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移等多種臨床病理參數(shù)的風(fēng)險評估模型，該模型預(yù)測效能較好，同時也提示PER1 可能是生物鐘基因中影響胃癌預(yù)后的關(guān)鍵基因。

針對PER1 基因在腫瘤中的作用，目前研究結(jié)論不一致。SATO 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PER1 在牙齦癌中起抗凋亡作用。而HAN 等［17］認(rèn)為PER1低表達能夠促進膽管癌的發(fā)展。還有研究表明，沉默PER1 能夠抑制口腔鱗狀細胞癌增殖，促進凋亡，同時調(diào)控其他多種生物鐘基因的表達［18］。由此可見，多種生物鐘基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，PER1在其中發(fā)揮主要作用，從而印證了本研究以PER1為核心構(gòu)建預(yù)后評估模型的重要性。當(dāng)然，我們?nèi)孕枰獞?yīng)用大量胃癌樣本，驗證多種生物鐘基因表達及其與胃癌預(yù)后的關(guān)系，完善RS 評估模型的準(zhǔn)確性；同時從分子水平進一步驗證PER1 促進胃癌進展的相關(guān)分子機制，為明確生物鐘基因在胃癌中的作用及靶向藥物開發(fā)提供新的方向和思路。

綜上所述，生物鐘基因PER1、CRY2和RORA與胃癌預(yù)后密切相關(guān)，基于PER1 聯(lián)合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠端轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)構(gòu)建的風(fēng)險評估模型在預(yù)測胃癌預(yù)后方面有較好的應(yīng)用效能，PER1也可能成為胃癌治療的新靶點。