Wnt7a在兔腓腸肌急性鈍挫傷后修復過程中的作用

李嫚嫚 馬惠昇，2 穆靜

骨骼肌是人體最大的組織，直接參與人體的各項生命活動。而骨骼肌損傷在日常生活中也尤為常見，其中90%的骨骼肌損傷是骨骼肌鈍挫傷，是由鈍器擊打或碰撞引起皮內或皮下以及軟組織局部水腫、出血、肌纖維斷裂、溶解等為主要改變的閉合性損傷[1，2]。骨骼肌損傷后的修復質量是由肌纖維再生和結締組織重塑的協調性決定的，瘢痕組織過度增生則會影響整個骨骼肌的收縮功能[3，4]。本研究通過建立日本大耳兔骨骼肌急性鈍挫傷模型，觀察損傷后不同時間點的腓腸肌組織形態，初步分析以Wnt7a 為代表的非經典Wnt 信號通路表達水平的變化與骨骼肌鈍挫傷后修復的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇6月齡日本大耳兔40 只, 體重1.75～2.20kg，雌雄各半，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心SPF級動物房，常規飼養。

1.2 主要試劑和儀器主要試劑：4%多聚甲醛（上海尚寶生物科技公司）；蘇木精-伊紅（HE）染液、Trizol、DEPC 水（北京索萊寶科技有限公司）；異丙醇(天津市永大化學試劑有限公司)；HiFiScript 快速去除基因組cDNA 第一條鏈合成試劑盒[康為世紀（Cat.NO.CW2582M）]；UltraSYBR Mixture 熒光定量試劑盒[康為世紀（Cat.NO.CW0957H）]。

主要儀器：臺式高壓蒸汽滅菌鍋、生物顯微鏡、圖像采集系統（Olympus）、低溫離心機、全波長酶標儀（BioTek）、渦旋振蕩儀（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）、生物分光光度計（Eppendorf）。

1.3 骨骼肌急性鈍挫傷模型建立自制軟組織鈍挫傷重力砸傷器，砝碼（直徑7.0cm,長10cm，質量3kg），固定導管（直徑8.0cm，高50cm）。從50cm 處落下，重力29.4N，產生重力勢能14.7J。造模前用剃毛器將實驗兔右腿內側皮膚被毛剔除。水合氯醛麻醉后，將實驗兔右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，打擊部位為右小腿內側面（其皮下為腓腸肌中段，中心點在跟骨上約7cm 處），將導管垂直置于實驗兔距腓腸肌受打擊中心表面50cm 高度，砝碼在導管上端，沿導管內自由落體下落致一次性打擊傷并標記。造模后通過大體觀察、觸診及病理學檢測，腓腸肌有一定收縮功能障礙且無骨折，屬急性腓腸肌鈍挫傷模型。砸傷器由同一人操作，以保證打擊力度、損傷部位及程度的一致性。

1.4 分組及取材40 只日本大耳兔適應性喂養兩周后，隨機選取5 只作為對照組，其余35 只制備腓腸肌急性鈍挫傷模型，然后隨機分為7 組(n=5)，各組分別在造模后1d、2d、3d、4d、5d、7d、14d 取材。取材前，耳緣靜脈注射水合氯醛麻醉，解剖并分離左側腓腸肌，迅速將離體的腓腸肌放在干凈的濾紙上均分為2 份，一份置4%多聚甲醛中固定，以備石蠟包埋HE 染色；另一份置-80℃冰箱保存，以備RTPCR 檢測。

1.5 腓腸肌組織HE 染色及病理學評價HE 染色光鏡觀察損傷骨骼肌形態學變化：將腓腸肌組織切成1cm×1cm×0.5cm 大小，用預冷的生理鹽水沖洗后放入標記好的包埋盒中，骨骼肌經4%多聚甲醛固定24h 后，石蠟包埋，于腓腸肌肌腹中段處橫切5μm 厚的連續薄片，切片脫蠟復水，蘇木精染色，1%鹽酸-酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水,二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 RT-PCR 檢測Wnt7a mRNA 表達水平從-80℃冰箱取出各組家兔腓腸肌組織約30mg，研磨后加入1ml Trizol 離心管中，充分振蕩混勻，靜置5～10min；加入0.2ml 氯仿混勻15～30s，然后靜置3min；用高速離心機（4℃，12 000rpm 15min）；取水相到新的EP 管中，加入0.5ml 異丙醇，混勻，冰浴10min；離心（4℃，12 000rpm 10min）；傾倒上層液體，用75%冰乙醇沉淀（1ml），混勻；再次離心處理（4℃，12 000rpm 5min）并干燥。加入DEPC 處理水溶解RNA，測濃度，根據逆轉錄體系調整RNA 濃度并計算逆轉錄所需上樣量，而后逆轉錄合成cDNA。取1μlcDNA，0.6μl 上、下游引物以及10μl Mix 反應液，并補水至25μl，構建 RNA 逆轉錄反應體系，行定量PCR 擴增，擴增條件: 95℃ 15min（預變性）、95℃ 10s（變性）、58℃ 30s（退火）、72℃ 30s（延伸）、72℃ 5min（再延伸）共 40 個循環。分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，同時在60℃～95℃進行溶解曲線分析。

1.7 引物設計與合成檢索根據NCBI GenBank 數據庫中Wnt7a 全長基因序列，應用Primer premier 5.0 軟件設計出Wnt7a 基因引物，上游引物 P1：5'-GCCAAGGTCTTTGTGGATG-3'；下游引物 P2：5'-AG CAGGTCTTAGTGGTGCA-3'。擴增片段長度157bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8 統計學方法采用SPSS 20.0 統計軟件進行單因素方差分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，以LSD 法進行組間兩兩比較。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨骼肌急性鈍挫傷后腓腸肌組織變化情況對照組腓腸肌肌纖維呈鈍角多邊形，形狀規則且排列整齊，肌纖維間隙大小一致，肌絲排列整齊，胞核呈圓形或卵圓形，位于肌纖維的周邊。與對照組腓腸肌組織相比，鈍挫傷后1d 組可觀察到肌外膜完整性被破壞、損傷肌細胞變圓肥大，細胞間質中存在大量的紅細胞和少量的炎性細胞，部分肌纖維斷裂；鈍挫傷后2d、3d 組有大量的炎性細胞浸潤，肌細胞仍然腫脹明顯，并可見空泡組織；鈍挫傷后4d 組紅細胞較前3d 減少、炎性細胞減少、巨噬細胞增多、肌纖維壞死；鈍挫傷后5d 組成纖維細胞增多、細胞排列紊亂；鈍挫傷后7d 組肌細胞腫脹減輕，鈍挫傷區內可見部分新生肌細胞以及成纖維樣細胞，細胞排列紊亂，可見明顯的結締組織填充，炎細胞浸潤減輕；鈍挫傷后14d 組可見肌絲扭曲，肌纖維明顯恢復，纖維化增加，損傷部位初步愈合。見圖1。

2.2 急性鈍挫傷后骨骼肌Wnt7a mRNA 表達變化RT-PCR 結果顯示，家兔骨骼肌鈍挫傷在自然恢復過程中，Wnt7a mRNA 表達水平呈逐漸升高的趨勢。對照組的平均Cq 值為1.01±0.02，鈍挫傷后1d、2d、3d、4d、5d、7d 與14d 組的平均Cq 值分別為1.69±0.17、2.05±0.21、3.83±0.89、6.27±0.99、7.56±1.14、13.55±0.85 與8.22±0.29。與 對照組相比，鈍挫傷后1d 和2d 組的平均Cq 值差異無統計學意義（P>0.05），鈍挫傷后3d、4d、5d、7d、14d 組的Cq 值差異均有統計學意義（P<0.05）。并且在骨骼肌鈍挫傷后Wnt7a mRNA 表達水平逐漸升高，在第7 天表達最高，隨后開始下降，鈍挫傷后14d 組明顯低于鈍挫傷后7d 組（P<0.05）。

圖1 腓腸肌急性鈍挫傷后組織形態學變化（HE 染色，×200）

3 討論

傳統中醫認為經筋具有約束骨骼主持運動的功能，《黃帝內經·痿論》：“陽明者，五臟六腑之海，主潤宗筋，宗筋主束骨而利關節也。”說明經筋是運動系統的重要組成部分，并對周圍組織結構起著保護作用。

現代醫學認為骨骼肌鈍挫傷主要表現為肌纖維的斷裂和肌細胞的溶解，目前研究認為骨骼肌損傷后的修復有三個過程[5，6]：第一個階段為損傷變性期，在骨骼肌損傷后1～3d 出現，當某些外力因素破壞肌肉的超微結構和周圍血管時，導致肌肉內血腫形成，損傷處的肌組織壞死退化，中性粒細胞開始浸潤。第二個階段為修復期，一般出現在骨骼肌損傷后的5～10d，巨噬細胞吞噬壞死的肌組織，損傷肌肉周圍的纖維基膜和漿膜間的肌衛星細胞激活、增殖與分化，融合形成新的肌管細胞，伴有毛細血管增生。第三個階段為肌肉塑形期，瘢痕組織的形成一般在骨骼肌損傷后2～3 周內發生，再生肌纖維分化成熟，受損的骨骼肌功能恢復。

Wnt7a 在骨骼肌損傷修復中發揮重要作用。Wnt7a 可通過多條非經典Wnt 信號通路，促進肌衛星細胞增殖和遷移，加速骨骼肌損傷修復過程[7]。以Wnt7a 為代表的非經典Wnt 信號通路的激活，可有效促進肌衛星細胞擴增、遷移， 促進骨骼肌損傷修復。Wnt7a 對損傷骨骼肌再生的調控機制是通過Wnt7a 與骨骼肌衛星細胞中的受體FZD7 結合導致細胞極化，并選擇性增加對稱干細胞擴增，促進骨骼肌衛星細胞的大量增殖[8]。Xu 等[9]通過對肌肉損傷后的大鼠給予rh-Wnt7a，表明rh-Wnt7a 的直接作用是促進骨骼肌中的肌纖維增生。骨骼肌再生期間Wnt7a 過表達可顯著促進損傷骨骼肌再生，增加了肌衛星細胞數量；骨骼肌中Wnt7a 缺失時則表現為損傷骨骼肌中肌衛星細胞數量顯著降低；這表明Wnt7a 可作為刺激肌肉修復的有效促肌原性因子[10，11]。本實驗顯示家兔腓腸肌急性鈍挫傷后1d、2d 組的Wnt7a mRNA 表達水平無明顯變化，第3 天后Wnt7a mRNA 表達顯著性升高，并在第7 天時表達最高，隨后開始下降。HE 染色顯示新生肌管和成纖維細胞在鈍挫傷后5～7d 開始顯著增多，而Wnt7a 也在第7天時達到最高水平，Wnt7a 表達上調與肌細胞再生的病理過程在時間上有一致性，因此推斷這是因為骨骼肌組織在損傷狀態下，Wnt7a 參與肌衛星細胞擴增、遷移的結果。有研究發現短時間的Wnt7a 治療顯著刺激了組織的散布和植入，從而顯著改善了肌肉功能[12]。用Wnt7a 治療肌肉損傷可通過增加衛星干細胞的數量以及最終增加整體衛星細胞池來加速肌肉修復。

綜上所述，Wnt7a 可能參與骨骼肌損傷的早期修復過程，推測損傷修復的速度很可能與Wnt7a 的表達水平密切相關。本實驗只涉及了早期階段，不能對骨骼肌鈍挫傷修復全過程做出定論，Wnt7a 在骨骼肌鈍挫傷后修復后期階段的確切作用還有待進一步研究。