纖維素酶CtCel8A的異源表達(dá)及其降解黃原膠性能

姜 海 珠， 周 海 龍， 谷 金 蕓， 李 憲 臻， 楊 帆

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034； 2.中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì), 北京 100833 )

0 引 言

現(xiàn)已報(bào)道的黃原膠降解方法有物理降解法[2](輻照法、超聲波等)、化學(xué)降解法[3-4](氧化劑、酸、堿等)和生物降解法[5](酶解)。其中，物理降解法常伴有交聯(lián)降解反應(yīng)，且自動(dòng)化設(shè)備處理能力受限，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[6]；化學(xué)降解法選擇性差，易產(chǎn)生副產(chǎn)物[7]；而酶法降解反應(yīng)條件溫和，選擇性好，是降解黃原膠主鏈的理想方法[8]。目前，酶法降解黃原膠的報(bào)道不多，且主要采用商品化纖維素酶對(duì)黃原膠的類纖維素主鏈進(jìn)行降解，但效果均不理想[9]。

來自熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)的纖維素內(nèi)切酶CtCel8A相對(duì)于其他來源的纖維素酶具有酶活力高、耐高溫的優(yōu)點(diǎn)[10]。因此，該酶被廣泛用于酶工程研究，目的是實(shí)現(xiàn)纖維素到燃料乙醇的生物轉(zhuǎn)化[11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)內(nèi)切酶CtCel8A的編碼基因進(jìn)行克隆，利用大腸桿菌的高表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行純化及酶學(xué)性質(zhì)表征，并考察該酶切割黃原膠主鏈的性能，以期為黃原膠寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供有效、可靠地生產(chǎn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EscherichiacoliDH5α，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pET-28a (+)和E.coliBL21 (DE3)，獲贈(zèng)于大連化物所趙宗保研究員課題組。

限制性酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、250 bp DNA Marker、PrimeSTAR HS DNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉15.0 g/L，其余同LB液體培養(yǎng)基[12]。當(dāng)進(jìn)行質(zhì)粒菌培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基添加終質(zhì)量濃度為30 μg/mL 的卡那霉素。

梯度PCR儀，艾本德股份公司；DYY-11型電泳儀，北京六一科技有限公司；ImageQuant成像分析系統(tǒng)，美國(guó)通用電氣公司；AKTA蛋白純化儀，美國(guó)通用電氣公司；JY92-IIN超聲破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；UV5200紫外光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；1260凝膠色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

纖維素內(nèi)切酶CtCel8A編碼基因Ctcel8的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建、鑒定所用引物均合成于寶生物有限公司。引物序列及功能如表1所示。

表1 引物序列及功能Tab.1 Sequences and functions of primers

1.2.2 纖維素內(nèi)切酶編碼基因Ctcel8的全基因合成

纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的核苷酸序列全長(zhǎng)為1 137 bp，由上海生工有限公司進(jìn)行全基因合成，合成的片段被亞克隆至通用載體pUC57，構(gòu)成pUC57-Ctcel8。

1.2.3 pET-Ctcel8表達(dá)載體的構(gòu)建

為了獲得帶有目的基因Ctcel8的表達(dá)載體，首先以上海生工有限公司合成的pUC57-Ctcel8為模板，引入帶有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的上游引物Cel-F和下游引物Cel-R進(jìn)行編碼基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：pUC57-Ctcel8 100 ng，dNTPs 5.0 mmol/L，引物40 μmol/L，5×Primer STAR buffer 20 μL，Prime STAR聚合酶2.5 U，加無菌水至100 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min[13]。擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用膠回收試劑盒進(jìn)行基因片段回收。將回收的PCR產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒用限制性酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，回收的酶切片段與質(zhì)粒(濃度比為1∶3)在16 ℃孵育2.5 h進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂于含有卡那霉素的LB平板上，篩選陽性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的表達(dá)與純化

將表達(dá)質(zhì)粒pET-Ctcel8轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取陽性單菌落進(jìn)行PCR鑒定，正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。

BL21(DE3)-Ctcel8種子液以1∶50的比例擴(kuò)培于500 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，OD600為0.6時(shí)加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG；發(fā)酵液于16 ℃誘導(dǎo)18 h；9 000g離心3 min后收集菌體，30 mL Binding buffer重懸菌體后，超聲波法裂解細(xì)胞。利用Ni-NTA瓊脂糖樹脂對(duì)帶有6His純化標(biāo)簽的纖維素內(nèi)切酶CtCel8A進(jìn)行親和純化，詳細(xì)步驟參照相關(guān)文獻(xiàn)[14]。所有蛋白質(zhì)樣品均用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)濃度用Bradford法[15]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的酶活測(cè)定

100 μL酶液與100 μL 0.1%黃原膠混勻，70 ℃ 反應(yīng)20 min，冰浴15 min終止反應(yīng)，在酶反應(yīng)體系中加入等體積冰冷的聚氰基丙烯酸正丁酯BCA溶液，75 ℃反應(yīng)30 min，在OD562處測(cè)量吸光度。陰性對(duì)照為沸水浴滅活的酶液[16]。

酶活力單位的定義：每分鐘釋放1 μmol葡萄糖所需酶的量為1 U。

1.2.6 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的最適溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定

酶的最適溫度實(shí)驗(yàn)是在20、30、40、50、60、70、80 ℃分別反應(yīng)20 min后測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力。將酶液分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃下連續(xù)孵育1 h后測(cè)定殘余酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，繪制酶熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.7 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定

酶的最適pH是將酶液分別用緩沖液調(diào)節(jié)pH至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，再于70 ℃與黃原膠反應(yīng)20 min進(jìn)行酶活力測(cè)定，以最高酶活力為100%，計(jì)算各pH下的相對(duì)酶活力。酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定實(shí)驗(yàn)是將酶液在不同pH的緩沖液中分別孵育2 h后，在pH 5.5、70 ℃條件下反應(yīng)20 min，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.8 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A降解黃原膠產(chǎn)物的凝膠滲透色譜分析

色譜柱采用三柱串聯(lián)(PL aquagel-OH 60，PL aquagel-OH MIXED-M和PL aquagel-OH 30分離柱)。柱溫設(shè)定為40 ℃，20 μL樣品(1 g/L)由0.1 mol/L NaNO3稀釋而成，體積流量0.8 mL/min。采用示差折光檢測(cè)。采用普魯蘭糖作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品。用各組分的積分折射率(RI)峰面積除以18～33 min測(cè)得的總RI峰面積，計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量分布[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素內(nèi)切酶編碼基因Ctcel8的全基因合成及序列分析

將上海生工有限公司合成的pUC57-Ctcel8(帶有密碼子優(yōu)化后的Ctcel8核苷酸序列)送寶生物公司測(cè)序，利用DNAStar軟件中的MegAlign比對(duì)程序?qū)y(cè)序結(jié)果與Genebank提交的Ctcel8核苷酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，如圖1所示。結(jié)果表明，DNA序列長(zhǎng)度為1 137 bp，共有156處密碼子成功地按照大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行了優(yōu)化，DNA序列的GC含量由優(yōu)化前的45.21%變?yōu)?0.92%。

2.2 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A表達(dá)載體及菌株的構(gòu)建

以pUC57-Ctcel8為模板擴(kuò)增纖維素內(nèi)切酶的編碼基因Ctcel8，凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。特異性條帶在1 100 bp左右，與目的片段Ctcel8的理論大小相符。利用凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段并送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)證明為纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的編碼基因，該基因編碼的纖維素內(nèi)切酶CtCel8A含有379個(gè)氨基酸殘基，理論分子質(zhì)量為41.8 ku，屬于糖苷水解酶GH8家族[18]。為了構(gòu)建基因Ctcel8的表達(dá)載體，將BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的基因片段Ctcel8及表達(dá)載體pET-28a于4 ℃過夜連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。隨機(jī)挑取陽性單克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，1～4號(hào)重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后有兩條特異性條帶，大小為1 200 和5 300 bp，與預(yù)計(jì)的酶切結(jié)果一致。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的表達(dá)載體pET-Ctcel8成功構(gòu)建。將表達(dá)載體pET-Ctcel8轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，挑取陽性克隆進(jìn)行表達(dá)。

2.3 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的異源表達(dá)及純化

在CtCel8A的表達(dá)菌BL21-pET-Ctcel8中加入終濃度1.0 μmol/L IPTG于16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。離心后收集菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，獲得CtCel8A的粗酶液。利用Ni-NTA親和填料對(duì)CtCel8A進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示，CtCel8A能夠成功地在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)。經(jīng)過平衡、親和吸附、洗滌、洗脫等步驟，獲得純度較高的CtCel8A條帶。目的蛋白CtCel8A分子質(zhì)量約為40 ku。

經(jīng)Bradford法檢測(cè)純化的CtCel8A結(jié)果質(zhì)量濃度為2.3 mg/mL，底物為黃原膠時(shí)，比酶活為98.3 U/g，目的蛋白質(zhì)的回收率為69.2%，純度大于95%，如表2所示。

2.4 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A水解黃原膠的性質(zhì)

2.4.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性

如圖5(a)所示，纖維素內(nèi)切酶CtCel8A在反應(yīng)溫度為60～70 ℃時(shí)酶活力相對(duì)較高，在溫度大于70 ℃時(shí)，酶活力急劇下降，該酶的最適酶促反應(yīng)溫度為70 ℃。由酶的熱穩(wěn)定性曲線(圖5(b))可知，CtCel8A在20～70 ℃進(jìn)行溫育時(shí)，酶活力能夠保持穩(wěn)定，在高于70 ℃時(shí)，隨著溫度升高酶的穩(wěn)定性迅速降低。

1，純化后目的蛋白；M，蛋白marker圖4 親和純化后CtCel8A的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE result of CtCel8A after affinity purification

表2 重組纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的純化結(jié)果Tab.2 Purification profile of recombinant CtCel8A

圖5 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A的最適溫度及熱穩(wěn)定性

2.4.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

CtCel8A最適pH測(cè)定結(jié)果如圖6(a)所示，在pH 5.5時(shí)酶活力達(dá)到最高值，隨著pH逐漸變化(低于5.0或高于6.5)，酶活力急劇下降。當(dāng)酶液在pH 5.0～8.5的緩沖液中溫育2 h后，均能夠保持穩(wěn)定的酶活力，一旦緩沖液pH超過該范圍，酶穩(wěn)定性急劇下降(圖6(b))。該結(jié)果說明CtCel8A對(duì)酸性或堿性環(huán)境的耐受能力較差。

圖6 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A最適pH及pH穩(wěn)定性

Fig.6 The optimum pH and pH stability of CtCel8A

2.4.3 黃原膠酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

利用凝膠滲透色譜對(duì)纖維素內(nèi)切酶CtCel8A水解黃原膠產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7所示。黃原膠酶解產(chǎn)物為兩種，一種為未降解的高分子質(zhì)量黃原膠(保留時(shí)間18～21 min)，一種為降解后的中等分子質(zhì)量黃原膠(保留時(shí)間21～24 min)。部分黃原膠未被降解的主要原因是，黃原膠高度致密有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)使得CtCel8A難以接近相應(yīng)的酶切位點(diǎn)[19]。與之前相關(guān)研究結(jié)果相比，纖維素內(nèi)切酶CtCel8A能夠有效地將高分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的黃原膠水解為中等分子質(zhì)量產(chǎn)物[20]。

圖7 纖維素內(nèi)切酶CtCel8A水解黃原膠的凝膠 滲透色譜Fig.7 Gel permeation chromatography elution patterns of xanthan after incubation with CtCel8A

3 結(jié) 論

對(duì)來自熱纖梭菌的纖維素內(nèi)切酶的編碼基因Ctcel8進(jìn)行了密碼子優(yōu)化和全基因合成，在大腸桿菌中對(duì)融合了His標(biāo)簽的Ctcel8進(jìn)行異源表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析表明該蛋白具有較高的可溶性表達(dá)水平，純化回收率達(dá)69.2%。對(duì)純化的CtCel8A進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明該酶的最適作用溫度為70 ℃，最適pH為5.5，對(duì)高溫的耐受力較強(qiáng)，但該酶對(duì)酸性及堿性環(huán)境的耐受力較差。凝膠滲透色譜結(jié)果表明，CtCel8A能夠有效地切割黃原膠主鏈，將其水解為中等分子質(zhì)量產(chǎn)物。