某粉殼蛋雞場禽流感、新城疫免疫抗體檢測及禽流感H7亞型病原學(xué)調(diào)查

林明星，余見棟

（平陽縣畜牧獸醫(yī)管理中心，浙江 平陽325400）

粉殼蛋雞是指由洛島紅品種與白來航品種的品系間雜交所產(chǎn)生的蛋雞，具有蛋重小、產(chǎn)蛋多、死淘低、體重適中、生活力強、適應(yīng)性好、性情溫順等特點[1]。其蛋呈淺褐色，介于褐殼蛋與白殼蛋之間，外觀、口感、營養(yǎng)價值等方面與土雞蛋相近，且產(chǎn)蛋量較放養(yǎng)土雞高，近年來對這種雞的需求量有增加的趨勢。禽流感（Avian fluenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種以禽類感染為主的傳染性疾病[2]，根據(jù)其不同的致病性可分為低致病性禽流感和高致病性禽流感。新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒引起的一種高度接觸性、急性、烈性傳染病[3]。禽流感和新城疫是禽類養(yǎng)殖過程中較為常見的兩種病毒性傳染病，可引發(fā)禽類呼吸道感染、產(chǎn)蛋量等生產(chǎn)性能下降、繼發(fā)其他疫病等，嚴重的還會導(dǎo)致急性死亡[4]，嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。H7亞型禽流感是高致病性禽流感，不僅感染禽類還可感染人，是一種人畜共患病，具有公共衛(wèi)生意義。大量研究[5-6]和實踐證明，應(yīng)用疫苗的免疫接種可有效預(yù)防和控制這兩種疾病的發(fā)生與流行。為了解平陽地區(qū)某蛋雞養(yǎng)殖場禽流感和新城疫免疫效果及禽流感H7亞型病毒感染狀況，提高養(yǎng)殖場對禽流感和新城疫免疫的重視，減少這兩種疫病的發(fā)生，于2018—2020年每3個月對該規(guī)模粉殼蛋雞養(yǎng)殖場進行采樣，檢測其禽流感、新城疫免疫抗體水平及禽流感H7亞型病原，旨在了解養(yǎng)殖場的禽流感和新城疫的免疫及禽流感H7亞型病毒感染情況，為養(yǎng)殖場制訂科學(xué)的免疫程序提供參考依據(jù)，在這兩種疾病的防控中提供一些思路和參考。

1 材料

1.1 樣品

2018—2020年對平陽縣某規(guī)模粉殼蛋雞養(yǎng)殖場開展每季度1次共10次的采樣和流行病學(xué)調(diào)查工作，共采集血清樣品、雞喉肛棉拭子各329份。

1.2 養(yǎng)殖場的免疫情況

7日齡，雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗飲水；14日齡，傳染性法氏囊病活疫苗滴鼻，雞痘翅內(nèi)穿刺；23日齡，傳染性法氏囊病活疫苗飲水；33日齡，雞新城疫活疫苗飲水；53日齡，雞新城疫活疫苗飲水；63日齡，重組禽流感病毒（H5+H7）滅活疫苗皮下注射；73日齡，重組禽流感病毒（H5+H7）滅活疫苗皮下注射；之后每隔40 d雞新城疫活疫苗飲水1次。

1.3 主要試劑

血凝抑制試驗用禽流感H5亞型、禽流感H7亞型、新城疫病毒抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司、青島易邦生物工程有限公司；禽流感病毒H7N9亞型實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，購自哈爾濱國生科技股份有限公司；紅細胞懸液用PBS配成1%雞紅細胞懸液，阿氏液、磷酸鹽緩沖液（PBS），按相關(guān)方法自行配制，4℃冰箱保存，備用。

1.4 儀器設(shè)備

微量移液器（規(guī)格為10μL、100μL、200μL等）、ABI Step One熒光定量PCR儀等，96孔V型微量板、一次性滴頭等，均購自杭州杰萌動物疫病防控科技有限公司。

2 方 法

2.1 血清學(xué)檢測

禽流感和新城疫免疫抗體檢測按照《禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2003）、《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550—2008）規(guī)范進行，采用血凝（HA）試驗檢測標(biāo)準(zhǔn)抗原的血凝價，制備4單位抗原并驗證，采用血凝抑制（HI）試驗分別檢測血清樣品的禽流感（H5、H7）及新城疫抗體效價，每次檢測的抗體效價以lg值表示。

2.2 病原學(xué)檢測

禽流感的病原學(xué)檢測按照《H7亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》（GB/T 19438.3—2004）進行，每次檢測結(jié)果以Ct值表示。

2.3 結(jié)果判定與統(tǒng)計分析

新城疫抗體效價≥5 lg、禽流感HI抗體效價≥4 lg判定為免疫合格，Ct值≤35為H7N9亞型禽流感病毒核酸陽性。利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和合格率等的統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 血清學(xué)檢測結(jié)果

通過2018—2020年每3個月對該規(guī)模粉殼蛋雞養(yǎng)殖場進行采樣，檢測其禽流感、新城疫免疫抗體水平，共檢測10個批次329份產(chǎn)蛋雞血清樣品。其禽流感H5亞型10個批次的樣品免疫合格率均在83%以上，免疫抗體效價平均值在5.69～9.49 lg之間；禽流感H7亞型有9個批次的樣品免疫合格率在83%以上，免疫抗體效價平均值在4.87～9.37 lg之間，僅2018年第一季度的樣品免疫合格率低于70%；新城疫10個批次的樣品免疫合格率均在94%以上，免疫抗體效價平均值在8.51～10 lg之間，具體檢測結(jié)果見表1。不同批次時間段樣品的免疫抗體效價均值變化趨勢見圖1，從圖1中可知，禽流感、新城疫免疫抗體水平各批次之間存在差異，其中禽流感H7亞型波動較大，新城疫則較為平穩(wěn)。

3.2 病原學(xué)檢測結(jié)果

通過2018—2020年每3個月對該規(guī)模粉殼蛋雞養(yǎng)殖場進行采樣，共采集329份雞喉肛棉拭子樣品進行H7亞型禽流感病原學(xué)檢測，結(jié)果H7亞型禽流感病原學(xué)檢測陽性數(shù)為0，無H7亞型禽流感陽性樣品，具體檢測結(jié)果見表1。

表1 禽流感、新城疫免疫抗體及禽流感病原學(xué)檢測情況

圖1 不同批次時間段樣品的禽流感、新城疫免疫抗體效價均值變化情況

4 討 論

由血清學(xué)檢測結(jié)果可知，除2018年第一季度外，禽流感H5亞型、H7亞型和新城疫免疫合格率均達到國家規(guī)定的規(guī)模養(yǎng)殖場免疫抗體合格率75%以上的水平。禽流感被列入重大動物疫病強制免疫計劃，政府統(tǒng)一采購疫苗，在2018年之前使用的是H5亞型的禽流感疫苗，這可能是導(dǎo)致2018年第一季度H7亞型禽流感免疫抗體效價低的原因。該養(yǎng)殖場免疫效果最理想的是新城疫，通過其免疫程序可知，該養(yǎng)殖場使用新城疫活疫苗免疫次數(shù)頻繁。使用新城疫活疫苗飲水免疫，除疫苗本身外影響其免疫效果的因素眾多，比如稀釋用水、容器、飲水時間等[7]，重復(fù)多次的免疫可以提高免疫抗體水平，同時因活疫苗易發(fā)生生物污染帶來一定的風(fēng)險，過度免疫也使養(yǎng)殖成本增加。根據(jù)相關(guān)研究[8-9]，為避開母源抗體對疫苗免疫效果的不良影響，但不遲于母源抗體低于臨界值，蛋雞禽流感首次免疫應(yīng)在10～21日齡，該養(yǎng)殖場首免在63日齡，存在免疫空白期，應(yīng)提早首免日齡。總體上看該規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖場注重疫苗的免疫，免疫程序?qū)嵤┗镜轿坏柽M行適當(dāng)調(diào)整。

經(jīng)H7亞型禽流感病原學(xué)檢測，3年來檢測結(jié)果均為陰性，表明該規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖場在生物安全管理、防控措施落實等方面均比較到位，有效降低了疫病發(fā)生風(fēng)險。

禽流感病毒感染人的情況時有發(fā)生，自2013年報道上海出現(xiàn)首例人感染禽流感病例以來，截止到目前共發(fā)生5次大流行，據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計，截至2019年9月1日，H7N9亞型禽流感作為一種嚴重人獸共患病，已造成1 626人感染，624例死亡，其中有禽類接觸史的有201名患者，嚴重威脅我國公共衛(wèi)生安全[10]。鑒于H7N9亞型禽流感的嚴峻態(tài)勢，為控制病毒的傳播，2017年9月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動了家禽H7N9亞型禽流感疫苗接種計劃。目前H7N9亞型禽流感流行趨勢基本得到控制，但是新的H7N9病毒基因型還在出現(xiàn)，仍然需要給予重點關(guān)注。本次專項監(jiān)測，采用每3個月1次的抽樣方案，可更及時了解規(guī)模禽場的禽流感和新城疫的免疫效果和禽流感H7亞型病毒感染狀況，盡早發(fā)現(xiàn)防控工作中的隱患，具有更強、更有針對性的技術(shù)指導(dǎo)意義。