冬瓜育種基礎(chǔ)研究進展

胡陽，蔡美仲，梁紅艷，邱文兵，徐清華，李平

（1.荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北，434007；2.石首市天字號瓜蔬土地股份專業(yè)合作社）

冬瓜（Benincasa hispidaCogn.，2n=2x=24）屬葫蘆科冬瓜屬一年生蔓生草本植物，起源于中國和東印度，廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。冬瓜在我國南北方普遍栽培，我國廣東、廣西、福建等地以黑皮冬瓜為主，四川、江西、湖南、湖北、安徽等地以粉皮冬瓜為主[1]。節(jié)瓜（B. hispidavar.chiehquaHow.）又名毛瓜、北瓜，是冬瓜的一個變種，原產(chǎn)我國南部，為我國的特產(chǎn)蔬菜，主要分布于廣東、廣西、海南等地，在北方部分地區(qū)作為特菜栽培。我國冬瓜和節(jié)瓜的遺傳育種相關(guān)基礎(chǔ)研究起步較晚，國內(nèi)研究機構(gòu)和人員投入不多，限制了育種技術(shù)的提升與產(chǎn)業(yè)發(fā)展。近年來，隨著育種技術(shù)和手段的提升，冬瓜的育種也逐步深入，開展了一些分子方面的研究。本文從冬瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性、抗病育種和主要農(nóng)藝性狀的研究等方面進行了概述，旨在為冬瓜育種提供理論基礎(chǔ)。

1 遺傳多樣性研究

遺傳多樣性是物種長期進化的產(chǎn)物， 代表不同種質(zhì)材料間的遺傳變異程度， 研究遺傳多樣性可為物種的分類、進化、遺傳改良和良種選育提供理論依據(jù)[2]。瓜類作物遺傳多樣性的研究，如黃瓜[3，4]、南瓜[5，6]、西瓜[7，8]、絲瓜[9]、苦瓜[10，11]、瓠瓜[12]和西葫蘆[13]均有報道。

隨機擴增多態(tài)性DNA （Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)因簡單、快速、成本低而廣泛應(yīng)用于物種遺傳多樣性的研究[14，15]。早在1996年，孟祥棟等[16]就利用RAPD 技術(shù)對1 份粉皮冬瓜、1 份青皮冬瓜和1 份江心節(jié)瓜的資源進行鑒定評價， 發(fā)現(xiàn)3 份材料間的遺傳相似系數(shù)在0.86 以上，3 份材料的親緣關(guān)系很近，但所涉及的冬瓜、節(jié)瓜資源和分子標(biāo)記數(shù)量太少。Sureja 等[17]利用RAPD 對9個冬瓜自交系進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)兩兩間的遺傳距離在0.056～0.179，說明這9個自交系的遺傳背景很窄。Verma 等[18]利用RAPD 對10個冬瓜自交系進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)成對的遺傳距離在0.07～0.31， 說明所選10個自交系有廣泛的遺傳多樣性， 但選取的42 對RAPD 標(biāo)記的多態(tài)性比率僅為46%。Pandey 等[19，20]對34 份冬瓜資源通過RAPD 技術(shù)聚類分析時發(fā)現(xiàn)其遺傳相似系數(shù)在0.64～0.943，除了IVAG-223 外，其他33 份材料均可歸為一大類，且遺傳相似系數(shù)較高。張建軍等[21]利用RAPD 標(biāo)記對我國的70 份冬瓜資源進行遺傳分析， 發(fā)現(xiàn)品種資源間的遺傳相似系數(shù)在0.703～0.986，遺傳相似系數(shù)較高，說明選取的70 份冬瓜材料遺傳背景比較狹窄， 但聚類關(guān)系圖上不同熟性、皮色的冬瓜聚在一起， 說明選取的11 對RAPD 標(biāo)記與農(nóng)藝性狀不相關(guān)。宋世威等[22]利用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)對41 份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析， 種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.60～0.99，冬瓜和節(jié)瓜沒有聚成兩大類，而是交叉地分散到六大類群中，表明冬瓜和節(jié)瓜的親緣關(guān)系很近，分子水平上證明其屬于同一個種的不同變種。冬瓜各品種的相似系數(shù)多集中在0.60～0.80，而節(jié)瓜各品種的相似系數(shù)多集中在0.80～0.99，表明冬瓜的遺傳多樣性大于節(jié)瓜，節(jié)瓜的遺傳背景比冬瓜更狹窄。江彪等[23]利用簡單序列重復(fù)區(qū)間標(biāo)記技術(shù) （Inter-simple sequence repeat，ISSR） 對57 份冬瓜資源進行聚類分析， 結(jié)果表明，57 份冬瓜種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.26～1.00， 大部分在0.70 以上， 表明供試的57份材料間遺傳基礎(chǔ)狹窄。喬燕春等[24]利用相關(guān)序列擴增多態(tài)性 （Sequence related amplified polymorphism，SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)對38 份節(jié)瓜、冬瓜材料進行遺傳聚類分析發(fā)現(xiàn)， 遺傳相似系數(shù)在0.95～0.99，節(jié)瓜和冬瓜的遺傳背景非常窄，冬瓜與黃毛型節(jié)瓜的親緣關(guān)系近于與普通類型節(jié)瓜。王鵬等[25]利用ISSR對36 份節(jié)瓜自交系進行遺傳多樣性分析， 結(jié)果表明，36 份材料間遺傳相似系數(shù)在0.57～0.96，表明材料間遺傳多樣性較為狹窄。焦賢賢等[26]利用SSR 標(biāo)記對111 份冬瓜種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，多態(tài)率92.86%， 聚類分析發(fā)現(xiàn)在遺傳距離為0.70 的位置可將這些種質(zhì)分為6個類群， 其中相同果形、籽 形 的 種 質(zhì) 資 源 間 親 緣 關(guān) 系 較 近 。

利用RAPD、SRAP 和ISSR 等分子技術(shù)對冬瓜及其變種節(jié)瓜的親緣關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)大部分材料間的遺傳背景較窄，僅有少部分材料遺傳相似系數(shù)較低[18～20]。冬瓜和節(jié)瓜資源從瓜形、瓜色、大小等方面差別很大，但通過遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)其遺傳背景較窄，如何對冬瓜和節(jié)瓜進行遺傳分類、確定其親緣關(guān)系，還需要基因等方面的數(shù)據(jù)進一步證實。同時，遺傳多樣性的分析有利于國內(nèi)冬瓜、節(jié)瓜資源的雜優(yōu)利用，通過發(fā)掘冬瓜屬野生資源擴大冬瓜屬植物的遺傳類型，同時利用生物技術(shù)手段開發(fā)分子標(biāo)記，對冬瓜育種和遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

2 抗病性研究

冬瓜的常見病害種類有枯萎病（Fusarium wilt）、病毒病（Viral disease）、疫病（Phytophthora blight wilt）等，嚴(yán)重影響冬瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)，特別是南方地區(qū)高溫多雨，發(fā)病更加嚴(yán)重，選育多抗材料是冬瓜抗病育種亟需解決的問題[27]。近年來對于冬瓜的抗病性研究從病原菌鑒定[28～33]、抗病種質(zhì)資源的篩選[27，33，34]、抗性分子標(biāo)記的篩選[31，35]和抗病基因的同源克隆[36～39]逐步深入開展，取得了一定的成果。

由于冬瓜的遺傳背景狹窄，可利用的相關(guān)分子標(biāo)記較少，因而通過傳統(tǒng)的圖位克隆或轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法獲得抗病基因（R基因）難度較大[37]，但R基因表達(dá)產(chǎn)物存在許多高度保守的區(qū)域，如核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復(fù)序列（Nucleotide binding site and leucine rich repeat，NBS-LRR）、絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu) （Ser/Thr-kinase，STK）、 蛋白激酶類（Protein kinase，PK）等[40，41]。鑒于抗病基因同源序列可能為R基因一部分或與R基因緊密連鎖，因此根據(jù)這些抗病基因的保守序列設(shè)計引物，PCR 擴增同源序列，成為克隆該類抗病基因的有效途徑。目前，利用同源克隆法已從許多瓜類作物中分離了抗病基因同源序列（Resistance gene analogue，RGA），如黃瓜[42]、南瓜[43]、西瓜[44]、瓠瓜[45]等。

謝大森等[35]利用隨機擴增微衛(wèi)星多態(tài)性（Random amplified microsatellite polymorphism，RAMP）標(biāo)記技術(shù)，獲得了與冬瓜抗枯萎病材料B94抗性連鎖的分子標(biāo)記CGA-6380，CGA-6380 與抗性基因的遺傳距離為5.2 cM，分子和人工鑒定表明CGA-6380 標(biāo)記適宜篩選攜帶有抗枯萎病基因材料B94。趙芹等[37]利用黑皮冬瓜B98K 為試材，根據(jù)已克隆的植物NBS 類抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計簡并引物，得到19 條抗病同源序列，同源進化分析將其全部歸為non TIR-NBS-LRR 類。劉文睿等[38]利用NBS 類抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計簡并引物，從冬瓜抗病材料B227 基因組中分離獲得32 條特異抗病基因同源序列，其中17 條具有完整開放閱讀框，序列相似性分析結(jié)果表明， 這17 條序列均包含Ploop、Kinase-2 和GLPL 等保守結(jié)構(gòu)域， 屬于TIRNBS-LRR 類抗病基因。

由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎病是節(jié)瓜的重要病害。1994年，Ishiguro 等[46]從甘薯中克隆得到第1個WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆過程中起到重要的作用，張金平[36]克隆獲得了節(jié)瓜的第1個WRKY基因CqWRKY1，CqWRKY1在鐮刀菌酸毒素脅迫下被強烈誘導(dǎo)表達(dá)，此外CqWRKY1表達(dá)受信號分子水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)，由此可見判定CqWRKY1轉(zhuǎn)錄因子參與枯萎病防御反應(yīng)的調(diào)控。趙芹等[47]在節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體LT3 的基因組中分離克隆了22 條NBS 抗病同源序列， 均為non TIR-NBS-LRR 類。Mao 等[39]利用cDNA 末端快速擴增技術(shù) （Rapid amplification of cDNA ends，RACE）和同源克隆技術(shù)克隆了10個WRKY基因，在鐮刀菌酸毒素脅迫下發(fā)現(xiàn)4個基因的表達(dá)在抗感病節(jié)瓜品種中存在差異，其中CqWRKY31為正調(diào)節(jié)子，CqWRKY1、CqWRKY23和CqWRKY53為負(fù)調(diào)節(jié)子。

3 遺傳圖譜構(gòu)建及基因組測序

遺傳圖譜構(gòu)建是分子育種的基礎(chǔ)。早期，利用同工酶、RAPD 與AFLP 等標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，圖譜標(biāo)記稀少，性狀與標(biāo)記連鎖不緊密。高通量測序技術(shù)發(fā)展為高密度遺傳圖譜構(gòu)建帶來了方便，其中簡化基因組測序技術(shù)是一項快速、成本較低的高通量測 序 技 術(shù)。SLAF-seq （Specific-locus amplified fragment sequencing）簡化基因組測序技術(shù)結(jié)合了位點特異性擴增和高通量測序，可以用于全基因組范圍的SNP 開發(fā)和大范圍的基因分型。Jiang 等[48]利用SLAF-seq 技術(shù)對冬瓜進行了全基因組測序，測序包含2個親本和140個F2代單株，挑選了4607個多態(tài)性SNP， 構(gòu)建了包含12 條連鎖群的高密度遺傳圖譜，平均每條連鎖群上包含384個SLAF標(biāo)記， 總圖距為2172.86 cM， 標(biāo)記間平均距離為0.49 cM。這是在冬瓜上首次構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，可用于基因定位、分子標(biāo)記輔助育種和基于圖譜的基因克隆等工作。冬瓜的全基因組測序工作開展較晚，2019年對冬瓜開展全基因組從頭測序工作[49]，組裝的冬瓜基因組大小為913 Mb，其中859 Mb錨定到12個連鎖群，預(yù)測總共有689.5 Mb 的重復(fù)序列和27467個編碼蛋白質(zhì)的基因。同時分析了146 份冬瓜資源， 構(gòu)建了1 張包括1600萬個SNP位點的全基因組遺傳圖譜。通過對瓜類作物的比較分析發(fā)現(xiàn)，冬瓜是所有已知瓜類作物中保留最多祖先基因狀態(tài)的作物， 并推斷所有瓜類作物起源于1個擁有15 條染色體的祖先基因組。

4 果皮顏色及蠟粉研究

蔬菜作物的果皮顏色主要取決于果實發(fā)育階段、成熟度、色素同分異構(gòu)體的種類和數(shù)量等[50]，同時也受外界環(huán)境的影響，如栽培管理、植株朝向、是否遮蔭等。果皮顏色不僅是衡量果實發(fā)育和成熟狀態(tài)的重要標(biāo)志，也是外觀品質(zhì)的重要性狀之一[51]。對果皮顏色進行遺傳和分子研究是冬瓜育種多元化發(fā)展的必要，也是滿足消費者和市場多樣性的需求。冬瓜根據(jù)果實表皮顏色和被蠟粉與否可分為青皮冬瓜和白皮（粉皮）冬瓜，肉色有白、淡綠和青綠，果皮有黑色、深綠色、綠色和黃色。節(jié)瓜根據(jù)果皮顏色主要分為墨綠、青綠和白等幾種類型。

4.1 冬瓜果皮顏色研究

對冬瓜的蠟粉性狀進行遺傳研究， 發(fā)現(xiàn)粉皮對青皮為顯性，即有蠟粉對無蠟粉為顯性，這和黃瓜[52，53]、大白菜[54]、甘藍(lán)[55，56]、紅菜薹[57]等蔬菜作物中發(fā)現(xiàn)的蠟粉性狀遺傳模式相似。粉皮冬瓜與非粉皮冬瓜親本所配組合，F(xiàn)1代均為粉皮，但F1代的蠟粉厚度和均勻度有所差異， 這可能是有或多蠟粉對無蠟粉表現(xiàn)部分顯性，也可能是受細(xì)胞質(zhì)中DNA 的影響。

前人曾對苦瓜[58]、黃瓜[59，60]、西葫蘆[61]等 的果皮顏色遺傳規(guī)律進行研究，認(rèn)為遺傳規(guī)律有單基因控制的，也有多基因控制的。對青皮冬瓜果皮研究發(fā)現(xiàn)，綠皮對黃皮為顯性[62，63]，且綠皮和黃皮受1 對顯性核基因控制，劉文睿等[63]將控制冬瓜墨綠色果皮顏色基因定位在LG4 連鎖群，與目的基因連鎖的標(biāo)記是M14OD24，連鎖距離為4.5 cM。Jiang 等[48]利用SLAF-seq 技術(shù)構(gòu)建了冬瓜的高密度遺傳圖譜，利用六世代群體對冬瓜果皮顏色分析，發(fā)現(xiàn)冬瓜果皮顏色是由單基因控制的性狀， 深綠對黃色為顯性。基于高密度遺傳圖譜和表型數(shù)據(jù)，定位到1個與果皮顏色相關(guān)的QTL 區(qū)間，位于LG5 連鎖群上35.6 cM 的區(qū)間范圍內(nèi)， 連鎖的2個標(biāo)記分別是Marker44050 和Marker53003， 遺傳距離為1.0 cM和1.9 cM，表型貢獻率分別為82.66%和71.97%。

4.2 節(jié)瓜果皮顏色研究

對節(jié)瓜果皮披蠟粉性狀遺傳分析，發(fā)現(xiàn)蠟粉有無受1 對核基因控制， 有蠟粉對無蠟粉表現(xiàn)為顯性[64]。對節(jié)瓜果皮顏色進行遺傳研究，發(fā)現(xiàn)果皮深綠色與青綠色受1 對核基因控制，深綠色對青綠色為顯性[65]。黎炎等[66]研究發(fā)現(xiàn)，節(jié)瓜果皮蠟粉和顏色的遺傳規(guī)律一致，正反交F1代均偏向有蠟粉的親本和深綠色的親本， 但蠟粉的厚度和顏色的深淺有差別， 因此果皮蠟粉和顏色性狀除受2個主基因控制外，可能存在與之相關(guān)的修飾基因。朱冬冬等[67]利用群 體 分 離 分 析 法 （Bulked segregation analysis，BSA），在100 對ISSR 標(biāo)記中篩選出與節(jié)瓜墨綠色果皮基因連鎖的標(biāo)記G855-6，其交換值為8.95%，遺傳距離為9.04 cM。

5 其他農(nóng)藝性狀研究

冬瓜早熟性的主要構(gòu)成因素有初花出現(xiàn)所需天數(shù)、第一雌花著生節(jié)位、果實發(fā)育速率等[68]。于遠(yuǎn)等[69]對節(jié)瓜始雌花節(jié)位研究發(fā)現(xiàn)，其遺傳是由主基因和多基因控制的數(shù)量性狀，早熟性可以通過雜種優(yōu)勢來實現(xiàn)。謝大森等[70]對5個節(jié)瓜材料的7個產(chǎn)量相關(guān)性狀（單瓜質(zhì)量、瓜長、肉厚、雌性率、早熟性、病毒病抗性、瓜形指數(shù)）進行了遺傳分析，研究發(fā)現(xiàn)這7個性狀遺傳均屬于加性-顯性模式。謝大森等[71]對56個冬瓜品種的13個性狀進行了遺傳相關(guān)分析和通徑分析，結(jié)果表明，瓜長、瓜肉致密性與單瓜質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，中腔與單瓜質(zhì)量呈極顯著負(fù)相關(guān)，橫徑與單瓜質(zhì)量呈顯著負(fù)相關(guān)，瓜肉致密性是構(gòu)成冬瓜單瓜質(zhì)量的最主要性狀。種子千粒質(zhì)量是種子活力的重要指標(biāo)之一，劉文睿等[72]利用冬瓜材料B214（小籽粒）和B227（大籽粒）配制六世代群體對種子千粒質(zhì)量性狀進行遺傳研究，發(fā)現(xiàn)大小籽粒受1 對加性主基因+加性-顯性多基因控制，不存在雜種優(yōu)勢。主基因+多基因在B1、B2及F2群體的遺傳率分別為68.82%、75.70%和76.29%。

6 存在問題及展望

目前我國冬瓜的育種研究存在的主要問題有：冬瓜和節(jié)瓜的種質(zhì)資源相對較少、 種質(zhì)資源的收集、鑒定有待加強；基礎(chǔ)研究起步晚、研究深度不夠，對育種的貢獻率低；重要性狀的研究不足，遺傳規(guī)律和基因定位研究不深。因此，今后需要在以下方面加強研究：①深入開展冬瓜和節(jié)瓜遺傳多樣性研究，構(gòu)建核心種質(zhì)資源庫，為我國冬瓜和節(jié)瓜優(yōu)異種質(zhì)的挖掘、鑒定和利用提供參考；②加強基因組學(xué)研究， 繼續(xù)開展冬瓜和節(jié)瓜全基因組測序、基因組部分測序和簡化測序等工作，不斷完善冬瓜基因組，對重要功能基因進行快速發(fā)掘；③加快分子標(biāo)記輔助育種，實現(xiàn)分子育種與常規(guī)育種技術(shù)的緊密結(jié)合，提升冬瓜育種水平，創(chuàng)新種質(zhì)資源和培育新品種；④加強抗性機理研究，開展冬瓜枯萎病、疫病等的研究，建立人工接種、篩選技術(shù)體系，開展抗性相關(guān)基因組分析。