飼養密度對仔豬血清抗氧化、肝臟NAD+/NADH及嘧啶核苷酸代謝基因表達的影響

鮑彤彤 ，郜陸敏 ，張玉梅，吳 信，劉春龍

（1.中國科學院東北地理與農業生態研究所，黑土區農業生態重點實驗室，哈爾濱 150081；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，長沙 410125；3.中國科學院大學，北京 100049）

飼養密度是畜禽養殖重要參數之一，影響豬群健康和福利水平[1]。研究表明，飼養密度過低導致土地等資源浪費，增加豬維持凈能，不利于脂質積累；飼養密度過高顯著降低豬群平均日增重，不利于經濟效益[2]。因此在實際生產中，選擇合適飼養密度對于平衡經濟效益和豬群健康至關重要。

動物遇到有害刺激時，可通過調節神經內分泌系統和行為反應規避應激對機體影響。飼養密度過高，個體活動空間受限，動物無法及時規避應激源，導致機體應激反應增加[3]。血液抗氧化指標常被認為是應激標志物[4]。研究表明，飼養密度過高破壞動物體內氧化還原穩態，導致機體活性氧（ROS）水平升高，造成氧化應激，影響各類代謝反應[5]。機體抗氧化防御系統是對抗ROS的主要防御機制之一，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）等[6]。核苷酸及其代謝產物在機體各項生命活動中均發揮重要作用，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是氧化還原反應中傳遞電子的輔酶，參與三羧酸循環、氧化磷酸化等[7]，同時也是嘧啶核苷酸合成重要物質[8-9]。尿苷可與脂肪組織、膽汁酸等共同作用，調控機體能量穩態[10]。飼糧中添加單磷酸尿苷或尿苷類核苷酸可促進斷奶仔豬腸道發育，緩解斷奶應激[11]。另外，飼糧中添加外源核苷酸可提高斷奶仔豬免疫功能，提高機體抗應激能力，進而提高仔豬生長性能[12]。目前關于核苷酸代謝與應激研究多集中于添加外源核苷酸可緩解機體應激反應方面，但飼養密度是否影響仔豬核苷酸代謝尚未見報道。

因此，本研究探討飼養密度對仔豬抗氧化能力、嘧啶核苷酸合成和轉運相關基因表達的影響，旨在為生豬養殖業飼養密度合理選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取體重相近（10.32±0.07 kg）31 日齡仔豬（長白×大約克郡）66 頭，隨機分為3 組，每組6 個重復：A 組（低密度組）：2 m2內飼養2 頭仔豬；B 組（中密度組）：2 m2內飼養3 頭仔豬；C 組（高密度組）：2 m2內飼養6頭仔豬。

1.2 飼養管理

仔豬飼糧組成參照NRC（2012），符合該階段仔豬營養需求。仔豬自由采食，飲水充足。飼養前對豬舍全面消毒并保持干燥，圈舍溫度18～26 ℃，舍內自然通風，試驗期30 d?；A日糧組成及營養水平見表1。

1.3 樣本采集

試驗30d后，從各組隨機抽取1頭仔豬，禁食12 h，電擊麻醉（120 V，200 Hz），頸靜脈采血后屠宰取樣。采集空腸和肝臟樣品置于液氮速凍，于-80 ℃保存。血液樣本室溫靜置2 h后，于4 ℃條件下，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，于-80 ℃保存。

表1 基礎日糧組成及營養水平Table 1 Basal diet composition and nutritional level

1.4 血清抗氧化指標測定

抗氧化相關試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國，南京）和多功能酶標儀（Infinite M200 PRO，瑞士）測定仔豬血清中過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）水平，具體操作參照試劑盒說明書。

1.5 肝臟NAD+/NADH測定

NAD+/NADH 檢測試劑盒（WST-8 法）測定肝臟中NAD+與NADH 比值（碧云天生物技術有限公司，中國，上海）。根據試劑盒說明書操作后，用多功能酶標儀（Infinite M200 PRO，瑞士）檢測吸光值。并根據以下公式計算樣品中NAD+含量及NAD+/NADH 比值，NAD+和NADH 總量或各自含量用單位肝臟重量中含量表示。

1.6 總RNA提取與實時熒光qRT-PCR

取適量仔豬肝臟和空腸組織樣，在液氮中磨成粉狀后加入Trizol（碧云天生物技術有限公司，中國，上海），提取總RNA?？俁NA濃度采用紫外比色法測定，RNA 質量通過瓊脂糖凝膠電泳測定，并用DNase 去除DNA。反轉錄過程參照試劑盒說明書（TaKaRa 生物科技股份有限公司，中國，大連），即得到cDNA。

通過GenBank獲取相關基因序列，Prime 5.0設計引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，qPCR 擴增反應中使用引物序列見表2。參照試劑盒（Takara SYBR II，中國，大連）說明書，使用羅氏熒光定量PCR 儀（LightCycler 480II，德國，瑞士）作PCR擴增，檢測β-actin及核苷酸合成與轉運等基因相對mRNA 表達水平。使用2-ΔΔCt方法計算相對表達量。

表2 qPCR擴增反應中正向和反向引物序列Table 2 Forward and reverse primer sequences in qPCR amplification reactions

1.7 數據處理與統計分析

采用SPSS 21.0 軟件作單因素方差分析（ANO?VA），然后作Duncan 多重比較檢驗。數據以平均值±標準誤差（SEM）表示。P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼養密度對仔豬血清抗氧化能力的影響

飼養密度對仔豬抗氧化指標影響如表3 所示。與低密度組相比，高飼養密度顯著降低仔豬血清中CAT、GSH-PX和T-SOD水平（P＜0.05）。與中密度組相比，高飼養密度顯著升高仔豬血清中丙二醛（MDA）水平，降低GSH-PX和T-SOD水平（P＜0.05）。

2.2 飼養密度對仔豬肝臟NAD+/NADH的影響

飼養密度對仔豬肝臟NAD+/NADH 的影響如圖1所示，與低密度組相比，高飼養密度顯著上調仔豬肝臟中NAD+/NADH比值（P＜0.05）。

表3 飼養密度對仔豬血清抗氧化能力的影響Table 3 Effect of stocking density on antioxidant capacity in serum of piglets

圖1 飼養密度對仔豬肝臟NAD+/NADH的影響Fig.1 Effect of stocking density on the ratio of NAD+to NADH in liver of piglets

2.3 飼養密度對仔豬嘧啶核苷酸代謝相關基因mRNA表達的影響

飼養密度對仔豬肝臟嘧啶核苷酸合成相關基因mRNA 表達影響如圖2 所示。與低密度組和中密度組相比，高飼養密度極顯著下調仔豬肝臟中尿苷單磷酸合成酶（UMPs）mRNA 表達水平（P＜0.01）。與低密度組相比，高飼養密度組顯著上調肝臟中核糖核苷酸還原酶M（RRM）mRNA表達水平（P＜0.05）。

飼養密度對仔豬空腸嘧啶核苷酸合成相關基因mRNA 表達影響見圖3。與低密度組和中密度組相比，高飼養密度顯著上調仔豬腸道中氨甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸氨甲酰基轉移酶和二氫羥色胺酶尿苷單磷酸合成酶（CAD）mRNA 表達水平（P＜0.05）。與低密度組相比，高飼養密度極顯著上調腸道中UMPs的mRNA表達水平（P＜0.01）。

飼養密度對仔豬空腸嘧啶核苷酸轉運相關基因mRNA 表達影響如圖4 所示。與低密度組相比，高飼養密度顯著上調仔豬腸道中嘧啶核苷酸轉運相關基因SLC28A1、SLC28A2和SLC28A3的mRNA表達水平（P＜0.05）。與低密度組相比，中密度組SLC28A3的mRNA表達水平也顯著上調（P＜0.05）。

圖2 飼養密度對仔豬肝臟核苷酸合成相關酶mRNA表達的影響Fig.2 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide synthesis related enzymes in liver of piglets

圖3 飼養密度對仔豬空腸核苷酸合成相關酶mRNA表達的影響Fig.3 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide synthesis related enzymes in jejunum of piglets

圖4 飼養密度對仔豬空腸核苷酸轉運相關基因mRNA表達的影響Fig.4 Effect of stocking density on mRNA expression of nucleotide transport-related genes in the jejunum of piglets

3 討 論

3.1 飼養密度對仔豬血清抗氧化能力的影響

氧化應激是指動物體內氧化與抗氧化作用失衡，產生大量自由基，引起機體氧化損傷[13]。在集約化養殖過程中，應激源無處不在，對機體氧化還原穩態產生不利影響[14]。研究表明，高飼養密度增加機體內自由基產生，破壞機體氧化還原穩態[15]。本研究中，高飼養密度顯著降低仔豬血清中CAT、GSH-PX和T-SOD水平，與高飼養密度顯著降低大菱鲆血清中SOD、GSH-PX、CAT 等抗氧酶指標結果一致[16]。試驗結果表明，高飼養密度可能破壞仔豬氧化還原穩態，導致機體易受自由基攻擊，產生氧化損傷。

MDA 是反映氧化應激中脂質過氧化水平重要參數[17]。研究表明，高飼養密度引起肉雞氧化應激，血清中MDA 水平顯著升高[18]。氧化應激破壞ROS 產生與抗氧化系統之間平衡，刺激ROS 形成，導致脂質過氧化增加[19]。本研究中，與中密度組相比，高飼養密度組仔豬血清中MDA 水平顯著升高，與高飼養密度顯著增加肉雞血清中MAD 結果一致，表明高飼養密度引起仔豬氧化應激。

3.2 飼養密度對仔豬肝臟NAD+/NADH的影響

肝臟是哺乳動物最重要代謝器官，參與糖、脂、蛋白、核苷酸等多種代謝反應。NAD+作為一種傳遞電子輔酶，幾乎參與肝臟中各類代謝反應，在糖酵解、糖異生、三羧酸循環等能量代謝中發揮不可替代作用[20]。研究表明，降低NAD+/NADH 比值可通過催化α-酮戊二酸脫氫酶（A-KG?DH）活性促進ROS 產生[21]。NAD+也是蛋白質相互作用和DNA 修復的一種關鍵調節分子，NAD+可通過提高PPAR活性，提高細胞氧化損傷DNA修復能力[22]。另外，NAD+通過激活SIRT1，修復氧化損傷的血管[23]。本研究中高密度組肝臟NAD+/NADH 比值顯著高于低密度組，可能是高飼養密度條件下肝細胞自我保護機制，機體通過上調NAD+/NADH比值抑制ROS產生，減輕肝臟細胞氧化損傷。

3.3 飼養密度對仔豬嘧啶核苷酸代謝相關基因mRNA表達的影響

仔豬合成嘧啶核苷酸主要包括從頭合成和補救合成兩種途徑。從頭合成主要發生于肝臟，需消耗大量能量。補救合成則可利用體內游離的核苷和堿基，經簡單反應生成嘌呤核苷酸，該過程耗能較少。本試驗中，高密度組仔豬肝臟中嘧啶核苷代謝從頭合成關鍵酶UMPs 的mRNA 表達量顯著降低，而補救合成關鍵酶RRM 的mRNA 表達量較低密度組顯著升高。Ghoshal 等比較分析肝臟代謝組學，發現肝臟受到損傷時，核苷酸及其代謝產物均受影響[24]。因此推測，本試驗中從嘧啶核苷酸頭合成相關基因表達受抑制可能與高飼養密度引起仔豬肝臟氧化損傷有關。此外，動物處于應激狀態時，需更多能量應對機體應激綜合反應，維持內環境穩定[25]。研究表明，補充外源核苷酸可調控能量代謝，結合上述肝臟NAD+/NADH 結果，提示高飼養密度可能通過影響仔豬核苷酸代謝調控機體應激狀態下能量代謝[26-27]。由于補救合成節省能量和氨基酸消耗，因此推測高飼養密度對肝臟嘧啶核苷酸合成的影響也可能是機體在應激狀態下自我調節，但具體調控機制尚不明確，需進一步探究。

機體處于應激狀態時對核苷酸需求量迅速增加，核苷酸促進腸道細胞增殖和組織修復，研究表明，添加外源核苷酸有效增加斷奶仔豬腸道絨毛高度和隱窩深度、促進細胞增殖，緩解斷奶應激[28]。但也有研究發現，在未出現應激反應仔豬日糧中添加外源核苷時，仔豬腸道結構未有明顯改變[29]，說明腸道對核苷酸需求可能與機體健康相關。本試驗中，高飼養密度組仔豬腸道中嘧啶核苷酸合成和轉運關鍵酶CAD、UMPs、SLC28A1、SLC28A2 和SLC28A3 的mRNA 表達量均顯著上調，可能與應激狀態時小腸對核苷酸需求量增加有關。

4 結 論

綜上所述，高飼養密度降低仔豬抗氧化能力，影響嘧啶核苷酸合成和轉運，可能與高飼養密度引起仔豬應激反應有關。因此，集約化養殖模式下，應注意飼養密度過高帶來的不利影響，合理選擇飼養密度。