骨髓染色體制片方法探討

陳 超 周婷婷 王雙閣 路 放 李雨艷

吉林金域醫學檢驗所有限公司，吉林 長春 130000

物種的染色體組型在一定程度上具有該物種的特異性，并可在細胞層面上表現出該物種的進化過程。伴隨對染色體研究的不斷深入，科學家期望利用先進技術，使染色體內部結構分化染色，以獲得更具有特征鑒別功能的信息。骨髓細胞染色體實驗室制片方法具體包括秋水仙素處理、收集細胞、低滲處理、預固定、離心、再固定、再離心、制作細胞懸液、滴片、染色干燥、去浮色、鏡檢等步驟[1]。實驗操作較為簡單，但影響因素較多，如操作不當將不能獲得足夠的細胞中期分裂相。因此，本文對實驗室骨髓制片方法進行分析，實驗操作條件嚴格控制，對某些易錯方法進行改善，以期有效提高實驗成功率、提高標本中骨髓細胞中期分裂相。

1 秋水仙素處理

秋水仙素(又名秋水仙堿)，是從百合科植物秋水仙中提取出的一種生物堿，可抑制細胞進行有絲分裂，使染色體形態停留在分裂中期。細胞分裂相的多少、形態等是進行染色體研究的前提，傳統活體秋水仙素處理方法需要提前數小時甚至一天對實驗動物注射秋水仙素，但通過對制備的標本進行觀察發現染色體形態并不理想，難以進行染色體的細致觀察；而另一種傳統制備方法——血細胞體外培養法雖可獲得良好的染色體形態，但是需將血液細胞在體外無菌條件下培養3～5d，周期長，要求條件高[2]。兩種方法均有一定局限性，而對骨髓細胞進行體外短時間培養的同時進行秋水仙素處理可簡化操作步驟和縮短試驗周期，且該方法制作的染色體標本分裂相多、形態良好。具體操作：將收集到的骨髓細胞置于無菌培養液中，并加入秋水仙素(濃度達到10μg/mL)搖勻，封口后37℃培養箱中培養60min。本方法可快速簡單的制作出具有較高質量的染色體標本，且可大幅度減少昂貴試劑秋水仙素的用量。傳統活體注射法，秋水仙素的用量一般是每克動物體用量5～20μg，而本制備方法只需25μg左右，從而降低了試驗成本。并且此方法對于剛剛死亡和瀕臨死亡的實驗動物的染色體制作同樣具有重要意義。

2 低滲時間與室溫關系

自從徐道覺于1953年提出細胞體外培養與低滲技術以來，檢查染色體方法有了巨大進展。低滲可使細胞外的水通過細胞膜的滲透作用進入細胞內，導致細胞膨脹、體積擴大，進而使染色體均勻的分散，細胞膜變薄，保證在滴片時細胞膜易碎，制作出良好的染色體標本，以供鏡檢。其關鍵在于把控低滲時間，過短將導致細胞不易破碎；時間過長將導致細胞在滴片前已破碎。時間過短或是過長均得不到良好的制片效果。

以往，國外對低滲的時間和溫度要求較為嚴格，例如在15℃～30℃的情況下，低滲需要20min；在30℃以上需要13～15min。但這個范圍波動較大，制片成功率依舊較低。分析其原因是低滲時間不足所致，實驗室的溫度并不固定，室溫可影響器材、樣本、試劑的溫度，尤其是在北方，溫差較大，勢必影響進行低滲操作時的實際溫度。如在室溫15℃和30℃的情況下進行低滲操作，均進行20分鐘，前者時間不足，而后者時間多長，均會嚴重影響制片質量。為了使細胞在低滲過程中充分膨脹，在滴片是獲得最佳的染色體分散效果，對不同室溫條件下最適低滲時間 進行分析，得出低滲時間與溫度的關系符合方程y=-0.4344x+33.99[3]。因此在進行低滲操作時應以實驗室溫度為基礎，計算最佳低滲時間，允許存在誤差±2min。

3 固定液比例與固定次數

將經過低滲處理的細胞立即殺死并保持細胞形態的操作稱為固定，通過固定可使染色體分散良好、形態清晰。實驗室中常用的固定液為冰醋酸∶甲醇=1∶3的溶液。其中冰醋酸具有較強的滲透能力，固定蛋白質作用較強，易使染色體膨脹；而甲醇的作用除固定蛋白質外，還有收縮染色體的作用，所以必須嚴格控制二者比例，才可保證染色體形狀維持原形。且甲醇沸點在65℃左右，發揮較快，而冰醋酸沸點為118℃，發揮最慢。因此在配置固定液時應嚴格按照比例進行，最好試驗前臨時進行配置，這樣才能保證染色體形態維持正常狀態。由于骨髓中含有大量的脂肪組織，可導致制片整體昏暗，嚴重影響制片質量和閱片工作的正常進行。而反復進行固定2～3次，并更換固定液滴片，可提高制片的透光度，使背景清澈透亮。

4 離心速度與時間

離心可使細胞沉積在試管底部，方便進行提取。但細胞經過低滲、固定等處理后，細胞膜膨脹，比較脆弱，如離心速度過快或時間過長易導致細胞破裂，影響制片效果。因此要個控制離心速度和時間，一般將離心速度控制在1000轉/min，時間控制在10min，可得到較好的離心效果[4]。但可根據具體的低滲時間和固定次數進行調整，如低滲時間過長，可試單減慢離心速度，既能保證細胞在離心過程中不會破碎，還能保證細胞完全下沉。既不會丟失染色體，又能保障獲得良好的分裂相。

5 沖洗過程

在撥片染色結束后應利用雙蒸水經染液洗去。在沖洗過程中水流以緩慢為佳，禁忌直接沖洗細胞所在的位置，避免將染色體沖離玻片。

6 制片過程與環境的關系

染色體分析實驗結果與環境有一定關系，氣溫過低、過高，或是陰雨等天氣常常會對實驗效果產生負面影響。因此應嚴格控制實驗室環境，使其溫度、濕度等保持恒定，可利于染色體標本的制作。

7 結束語

染色體的形態和數目在同一物種內是相對穩定的，通過對其進行分析，可對該物種的遺傳指標進行了解。而優良的細胞學標本制作是了解染色體的第一步，因此要不斷對實驗室制片過程進行規范，以提高制片質量，為后期染色體觀察提供便利。