青花菜BoSCL3基因的克隆和漬水脅迫下的表達(dá)特征分析

裴徐梨, 付雙, 荊贊革,*, 唐征, 林燕, 黃麗

青花菜基因的克隆和漬水脅迫下的表達(dá)特征分析

裴徐梨1, 付雙1, 荊贊革1,2*, 唐征2, 林燕1, 黃麗1

(1. 昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 昆明 650214; 2. 溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 浙江 溫州 325006)

為了解(scarecrow-like 3)基因的功能，從青花菜(var.)中克隆得到1個(gè)基因，命名為，其cDNA全長(zhǎng)1 355 bp，編碼446個(gè)氨基酸。BoSCL3分子量為49.96 kD，為疏水性蛋白，與油菜()、蕪菁()中SCL3蛋白的親緣關(guān)系最近，同科植物的SCL3具有較高的同源性。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，青花菜基因表達(dá)量隨漬水脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先下降后上升，推測(cè)其可能參與漬水脅迫響應(yīng)。這為探討青花菜基因響應(yīng)漬水脅迫的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

青花菜；；基因克??；漬水脅迫

基因是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，由、和等3個(gè)基因家族成員的特征字母命名而來(lái)[1–2]。GRAS家族通常包含SAW、亮氨酸重復(fù)序列I (LFRI)、NLS、VHIID和亮氨酸重復(fù)序列II (LHRII)、PFYRE和LXX-LL等幾個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，可分為SHR、SCL、SCR、RGA、RGL (RGA- like)、GAI和PAT1等8個(gè)分支[3]。目前，GRAS轉(zhuǎn)錄因子已在擬南芥()、水稻(a)、白菜()、蓖麻()、玉米()和番茄()等植物中克隆出來(lái)[4–9]。

GRAS家族成員數(shù)量眾多，在植物逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。Torres-Galea等的研究表明干旱、鹽、低溫等非生物脅迫可促進(jìn)擬南芥的表達(dá)[1]。李雪燕等報(bào)道檉柳()的GRAS轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子含有多個(gè)逆境相關(guān)元件，推測(cè)其可參與植物的逆境脅迫響應(yīng)[10]。過(guò)表達(dá)水稻中的基因和甘藍(lán)型油菜中的基因，可提高植株對(duì)干旱脅迫的耐受性[11]。

青花菜(var.)為十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬一二年生草本植物。水分是青花菜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的調(diào)控因子，水分過(guò)多會(huì)嚴(yán)重影響生長(zhǎng)，甚至造成整株死亡。因此對(duì)青花菜漬水脅迫的響應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究，對(duì)于青花菜生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)從青花菜中克隆得到1個(gè)基因,對(duì)其編碼的BoSCL3蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)基因在漬水脅迫下的表達(dá)特性，為揭示青花菜基因響應(yīng)漬水脅迫的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為青花菜(var.‘WN12-95’)。種子催芽后，播種到營(yíng)養(yǎng)缽中, 放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。晝夜溫度為25℃/ 18℃, 光照周期為16 h/8 h。待植株長(zhǎng)至五葉期時(shí)開始漬水脅迫處理，每處理3次重復(fù)。分別在處理后0、2和6 d采集葉片，液氮冷凍后置于超低溫冰箱保存。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa公司)的操作說(shuō)明提取青花菜葉片的總RNA。總RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，使用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。

1.3 基因的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組unigene庫(kù)中青花菜基因設(shè)計(jì)全長(zhǎng)克隆引物，F(xiàn)：5?-TCGCTTTGATATGGTGGTT- ATGT-3?；R：5?-TCATTCACTTCTTGCATCTCCA-3?。PCR反應(yīng)體系包括1L cDNA，上、下游引物各1L、10Lmixture，7L ddH20。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃復(fù)性50 s，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行TA克隆，選取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

采用InterPro軟件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析；采用在線軟件ProtParamtool(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)氨基酸多肽鏈的氨基酸組成、等電量、相對(duì)分子量、分子式等[12–14]; 使用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)多肽鏈的親/疏水性; 采用GOR4工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cginbin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)對(duì)編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白序列同源性比對(duì)和進(jìn)化樹的構(gòu)建采用Mega 6.0軟件[15]。

1.5 BoSCL3基因的表達(dá)分析

根據(jù)獲得青花菜基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)定量引物，F(xiàn): 5?-CTTAACGCAACTCAGACAA-3?和R: 5?-CCATCTTCTCACCTTCCA-3?。以基因(引物分別為5?-GACAACTTACAACTCCATCAT-3?和5?-CTCATACGGTCAGCGATA-3?)為內(nèi)參基因。使用SYBR Premix Ex Taq (大連TaKaRa公司)試劑盒在ABI Prism 7500定量擴(kuò)增儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。反應(yīng)體系為：cDNA 1L，上、下游引物各1L, SYBR 10L，ddH2O 12L。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果和分析

2.1 BoSCL3基因的克隆及序列特征分析

采用特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，從青花菜葉片中克隆了基因(圖1)。序列分析表明該基因cDNA全長(zhǎng)1 355 bp，推導(dǎo)編碼446個(gè)氨基酸(圖2)。InterPro分析表明，該基因具有保守的結(jié)構(gòu)域，屬于基因家族。

圖1 青花菜BoSCL3基因的PCR擴(kuò)增。L: DL 2000 Marker; 1: BoSCL3。

2.2 BoSCL3蛋白的生物信息學(xué)分析

青花菜BoSCL3蛋白的分子量為49.96 kDa，理論等電點(diǎn)為6.14；帶負(fù)電殘基總數(shù)為51，帶正電殘基總數(shù)為45；疏水性最大值為3.04，親水性最大值為2.38，同時(shí)疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，說(shuō)明該蛋白為疏水性蛋白。

通過(guò)GOR4工具對(duì)蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 結(jié)果表明，青花菜BoSCL3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)(44.62%)、延伸鏈(Ee) (12.33%)和-螺旋(Hh)(43.05%)。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用BLAST對(duì)BoSCL3蛋白的氨基酸序列同源性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，基因編碼的氨基酸序列與甘藍(lán)()、油菜()、蕪菁()、白菜、蘿卜()、擬南芥中的SCL3氨基酸序列的同源性分別是100%、98%、98%、98%、91%和90%, 與煙草、長(zhǎng)葉馬先蒿、可可、毛果楊的相似性也都在60%以上。

將青花菜BoSCL3蛋白的氨基酸序列與甘藍(lán)、油菜、蕪菁、白菜、蘿卜、擬南芥(subsp.)、榴蓮()、長(zhǎng)蒴黃麻()、黃花蒿()、除蟲菊()、萵苣()、絨毛煙草()、蓖麻(）、毛果楊()等14種植物的SCL3氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)，可見，青花菜的BoSCL3與甘藍(lán)、油菜的SCL3親緣關(guān)系較近。同屬于十字花科的甘藍(lán)、油菜、蕪菁、蘿卜、白菜和擬南芥聚在同一分支上，表明同科植物的SCL3蛋白具有較高的同源性。

圖2 BoSCL3基因的全長(zhǎng)序列和推測(cè)的氨基酸序列。下劃線為引物序列。

圖3 基于SCL3蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 漬水脅迫下BoSCL3基因的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)青花菜漬水處理不同時(shí)間的表達(dá)特征。結(jié)果表明(圖4)，青花菜基因在漬水脅迫處理2 d時(shí)的表達(dá)受到抑制，相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.11。其后隨著漬水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，處理6 d的相對(duì)表達(dá)量為1.18。

圖4 漬水脅迫下BoSCL3基因的表達(dá)

3 結(jié)論和討論

本研究從青花菜中成功克隆到基因,對(duì)其編碼蛋白的親/疏水性、結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)和同源性進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。對(duì)漬水脅迫下青花菜基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步揭示青花菜基因響應(yīng)漬水脅迫的應(yīng)答機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵抗力和適應(yīng)能力具有重要作用[16–17]。本試驗(yàn)克隆得到1個(gè)青花菜基因，其編碼的蛋白具有GRAS家族的保守結(jié)構(gòu)域，為疏水性蛋白。石瑞等[18]報(bào)道的佛手(var.)的GRAS和陳裕坤等[19]報(bào)道的龍眼()胚性愈傷組織DlGRAS4與DlGRAS54的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似。將BoSCL3蛋白的氨基酸序列與薺藍(lán)、油菜、蘿卜、白菜、擬南芥等植物中GRAS家族的SCL3的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，表明約有80%以上的同源性，推測(cè)SCL3在功能上存在一定的保守性。

逆境脅迫是限制作物生長(zhǎng)的重要因子，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株形態(tài)發(fā)生變化。基因可在植物受到逆境脅迫時(shí)，產(chǎn)生應(yīng)答機(jī)制來(lái)提高植物的抗逆性，直接表現(xiàn)為表達(dá)量的變化。本研究中，漬水脅迫處理可對(duì)基因的表達(dá)量產(chǎn)生影響，說(shuō)明基因可能參與了青花菜的漬水脅迫響應(yīng)。前人的研究表明，水稻的表達(dá)量在受到鹽、干旱和外源ABA的脅迫時(shí)表達(dá)上調(diào)[20]。郭華軍等的研究也表明擬南芥13個(gè)基因在干旱和滲透脅迫處理下的表達(dá)均比對(duì)照顯著上升[21]。本試驗(yàn)中青花菜基因的表達(dá)量隨著漬水脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，呈先急劇下降后快速上升的變化趨勢(shì)，表明基因可能在青花菜漬水脅迫調(diào)控過(guò)程中具有重要作用。

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CloningGene fromvar.and Expression Analysis under Waterlogging Stress

PEI Xu-li1, FU Shuang1, JING Zan-ge1,2*, TANG Zheng2, LIN Yan1, HUANG Li1

(1. College of Agriculture and Bioscience, Kunming University,Kunming 650214, China; 2. College of Agriculture and Biotechnology, Wenzhou Vocational College of Science and Technology,Wenzhou 325006, Zhejiang, China)

In order to understand the function of(scarecrow-like 3) gene, agene was cloned fromvar., named, which full length of cDNA sequence was 1355 bp and encoding 446 amino acids. The molecular weight of BoSCL3 was 49.96 KD, predicted to be hydrophobic protein. Phylogenetic analysis showed that the SCL3 invar.(BoSCL3) was closely related to those inand, and SCL3 in the same family had high homology. The real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression ofdecreased at first and then increased with waterlogging stress time, indicating that this gene might be involved in response to waterlogging stress. Therefore, these would provide a theoretical basis for studying the molecular mechanism of BoSCL3 gene in response to waterlogging stress.

var.;; Gene clone; Waterlogging stress

10.11926/jtsb.4263

2020–06–10

2020–08–31

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY18C150006); 云南省地方本科高校(部分)基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)(2018FH001-044); 云南省科技廳基礎(chǔ)研究專項(xiàng)青年項(xiàng)目(2019-1-C-25318000002236); 浙江省科技廳項(xiàng)目(2016C051-5-3); 溫州市科技項(xiàng)目(2019ZX007-2)資助

This work was supported by the Project for Nature Sciences in Zhejiang (Grant No. LY18C150006); the Project for Fundamental Research of Local Undergraduate Universities (Partial) in Yunnan Province (Grant No. 2018FH001-044); the Special Project for Basic Research of Youth in Yunnan Science and Technology Department (Grant No. 2019-1-C-25318000002236); the Project of Department of Science and Technology in Zhejiang (Grant No. 2016C051-5-3); and the Project for Science and Technology in Wenzhou (Grant No. 2019ZX007-2).

裴徐梨(1990~ )，女，博士，講師，主要從事蔬菜分子生物學(xué)研究。E-mail: xuliP@163.com

. E-mail: jingzange@aliyun.com