磷酸化處理對蠶蛹多肽結合鈣能力的影響

王思遠，趙梓月，穆利霞，鄒宇曉，廖森泰，王衛飛

(廣東省農業科學院 蠶業與農產品加工研究所/廣東省農產品加工重點實驗室/農業農村部功能食品重點實驗室，廣東 廣州 510610)

目前，市場上的補鈣產品主要有以碳酸鈣為代表的無機鈣和以葡萄糖酸鈣、乳酸鈣和檸檬酸鈣等為代表的有機鈣，這些產品普遍存在結構不穩定和生物利用率低等問題[1]。研究發現，一些來自食物中的多肽可與鈣、鐵、鋅等二價金屬離子結合形成配位鍵，所生成的金屬螯合物結構穩定、易吸收，從而可促進礦物元素的吸收和利用[2-3]。多肽與鈣結合的機制主要有磷酸基團- 鈣、羧基- 鈣兩種模式。酪蛋白磷酸肽(CPPs)是目前為止發現的促鈣吸收效果最好的短肽，已作為鈣強化劑廣泛應用于嬰幼兒食品及其他補鈣類功能食品中。研究表明，當對CPPs進行脫磷處理后，其結合鈣活性基本喪失，充分說明了磷酸基團在與鈣結合中的重要作用[4]。

蛋白的化學改性是利用多肽的羧基、氨基、羥基等活性基團發生水解、烷基化、酰化、磷酸化等反應，通過改變蛋白質的結構、電荷、疏水基團等，達到改變蛋白質的功能特性[5]。蛋白化學改性具有反應簡單、應用廣泛和效果顯著等特點。磷酸化修飾被證明是可以提高食品蛋白質功能性質的比較重要和有效的改性修飾技術[6]：如Yu等[7]研究了三聚磷酸鈉改性制備磷酸化改性花生分離蛋白，改性后樣品的溶解性、乳化活性、起泡性、持水性和吸油性等理化特性均有所改善；Enomoto等[8]通過對α-乳清蛋白進行磷酸化修飾，對脂肪的抗氧化能力和免疫活性等均有提高。

近年來，國內外學者致力于尋找高效、低成本的多肽材料，已從多種食品蛋白，如大豆、南極磷蝦、太平洋鱈魚、烏鱧等[9-12]中制備出金屬螯合肽，并發現這些肽類在改善鈣等二價礦物元素生物利用度方面具有極大的潛力。本研究團隊前期開發了一種蠶蛹多肽結合鈣，該產品可溶性好，含鈣量高。本研究擬利用磷酸化試劑對蠶蛹多肽進行磷酸化改性，考察磷酸化蠶蛹多肽的結合鈣能力與結構變化，并對磷酸化反應的工藝進行優化，希望通過增加磷酸化位點，進一步提高多肽的結合鈣能力，為多肽結合鈣補鈣制劑的開發提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮削絲蠶蛹(兩廣2號)，廣東韶關翁源縣真誠意蠶桑專業合作社。

Alcalase酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，諾維信(中國) 生物技術有限公司；石油醚、鹽酸、無水乙醇、檸檬酸鈉、Na2S、CaCl2、NaCl、Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6，均為分析純，天津市大茂化學試劑廠；NaOH、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，分析純，福晨(天津)化學試劑有限公司；絡黑T，分析純，天津市天新精細化工開發中心；KH2PO4，分析純，廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；CR 22GⅢ型高速冷凍離心機，日本日立公司；FD5508型真空冷凍干燥機，韓國ilshin公司；Nicolet IS5型傅立葉紅外光譜儀、EASY-nLC 1000型高效液相色譜儀、Orbitrap Elite型質譜儀，美國Thermo Scientific公司；XL-30-ESEM型掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1蠶蛹多肽的制備

取新鮮蠶蛹，沸水漂燙2 min，在60 ℃烘箱中烘干，粉碎過40目篩，加入石油醚脫脂，制得脫脂蠶蛹粉。取一定質量的脫脂蠶蛹粉，加蒸餾水配制成質量分數10%的溶液，再加入Alcalase酶酶解4 h，沸水中滅酶5 min，離心取上清液制得蠶蛹多肽溶液。

1.3.2多肽結合鈣復合物的制備

本研究團隊前期已確定了多肽結合鈣復合物的制備條件[13]，具體工藝如下：

取1.3.1中已經制備的蠶蛹多肽溶液，按肽鈣質量比3.4∶1.0加入CaCl2。調節溶液pH值為10，73 ℃反應80 min，加入4倍體積95%乙醇溶液進行沉淀，離心后取沉淀，冷凍干燥后得蠶蛹多肽給合鈣復合物。

1.3.3磷酸化改性蠶蛹多肽結合鈣復合物的制備

本研究團隊前期通過單因素實驗，以鈣結合量為指標，分別采用反應溫度(30、40、50、60 ℃)、反應時間(0.5、1、2、3 h)和pH值(6、7、8、9、10)，考察不同磷酸化反應條件對蠶蛹多肽結合鈣含量的影響，確定了多肽磷酸化處理的優化條件為：pH值8，反應溫度40 ℃，反應時間1 h。

磷酸化改性蠶蛹多肽結合鈣復合物的制備：取1.3.1中蠶蛹多肽溶液，加入適量磷酸化試劑，調節pH值為8，40 ℃恒溫水浴反應1 h，按肽鈣質量比3.4∶1.0加入CaCl2，調節pH值為10，73 ℃反應80 min，加入4倍體積95%乙醇溶液進行沉淀，離心后取沉淀，冷凍干燥后得磷酸化蠶蛹多肽結合鈣復合物。

1.3.4磷酸化試劑對蠶蛹多肽結合鈣含量的影響實驗

分別采用0.1 mol/L的Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6作為磷酸化試劑，考察不同磷酸化試劑對蠶蛹多肽結合鈣含量的影響。

分別采用質量分數為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%的NaH2PO4作為磷酸化試劑，考察不同添加量的磷酸化試劑對蠶蛹多肽結合鈣含量的影響。

1.3.5鈣含量測定

參照GB/T 5009.92—2016 中的EDTA滴定法。

1.3.6磷標準曲線繪制與磷含量測定

準確吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL磷標準使用液，分別置于25 mL容量瓶中。依次加入2 mL鉬酸銨溶液(50 g/L)，搖勻靜置30 s。加入1 mL亞硫酸鈉溶液(200 g/L)、1 mL對苯二酚溶液(5 g/L)后定容、搖勻。靜置0.5 h后，在660 nm處測定溶液吸光度，繪制標準曲線(見圖1)，回歸方程為y=0.004 6x+0.000 2，R2=0.999 5，其中，y為吸光值，x為含磷量。

圖1 磷標準曲線Fig.1 Standard curve of phosphorus

1.3.7產品結構表征

蠶蛹多肽分子中含有羧基、羥基、氨基等基團，為研究磷酸化處理后，蠶蛹多肽的結構變化，探索肽鈣結合方式，對蠶蛹多肽結合鈣復合物和磷酸化蠶蛹多肽結合鈣復合物樣品進行紅外光譜分析和磷酸化修飾的位點檢測。

1.3.7.1 紅外光譜分析

取磷酸化蠶蛹多肽結合鈣復合物樣品，在波數為4 000～400 cm-1的范圍內進行紅外光譜分析。

1.3.7.2 磷酸化位點檢測

取蠶蛹多肽結合鈣復合物和磷酸化蠶蛹多肽結合鈣復合物樣品各2 mg，加入500 μL質量分數為0.1%的甲酸溶液，置于振蕩器上振蕩至兩種樣品全部溶解。取20 μL 完全溶解的樣品，使用100%乙腈活化除鹽柱進行洗脫，將洗脫溶液離心濃縮干燥，去除乙腈，真空干燥后取1～2 μg樣品上機。用液相色譜儀進行分離，使用自填的 Trap 柱(C18，5 μm，100 μm×2 cm)和分析柱(C18，1.9或2.4 μm，75 μm×20 cm)，流速為200 nL/min。串聯質譜檢測采用的是數據依賴掃描(data dependent acquisition，DDA)模式。全掃分辨率為60 000 (FWHM)，質荷比范圍設定為m/z350～1 600，HCD碎裂模式下，碰撞能量設置35%。

1.3.8掃描電鏡分析

取一定量蠶蛹多肽、蠶蛹多肽結合鈣復合物和磷酸化蠶蛹多肽結合鈣復合物樣品，將樣品抖落至樣盤雙面膠上，經過噴金鍍膜處理后放入掃描電鏡抽真空，施加一定電壓后，在放大1 000倍數下獲取掃描圖像。電鏡掃描條件設定為：高壓5.00 kV，束流6.9×10-2mA，工作距離8.5 mm。

1.4 數據處理

每個實驗重復3次及以上，數據用平均值±標準誤差(mean±SD)表示，應用EXCEL軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 不同磷酸化試劑的改性作用及對蠶蛹多肽結合鈣能力的影響

不同磷酸化試劑的磷酸化作用及對肽鈣結合的影響，實驗結果如表1。表1顯示：對照組的磷含量為37.26 mg/g,表明蠶蛹多肽中已含有少量磷酸基團；磷酸化處理后，樣品中磷和鈣的質量分數顯著高于未改性組，說明這些多肽中的某些基團被磷酸化了，且引入的磷酸基團又與鈣離子發生了結合；不同于磷酸試劑處理蠶蛹多肽，改性后制得的多肽結合鈣樣品的鈣、磷含量無顯著差異，表明這3種試劑對蠶蛹多肽的磷酸化作用相近。從食品安全和成本角度綜合考慮，選擇NaH2PO4為改性蠶蛹多肽制備肽鈣復合物的磷酸化試劑。

表1 不同磷酸化試劑對磷酸化蠶蛹多肽結合鈣中的鈣與磷含量的影響Tab.1 Effect of different kinds phosphorylation reagents on content of calcium and phosphorus of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-calcium complex mg/g

2.2 磷酸化水平對蠶蛹多肽結合鈣能力的影響

采用不同質量分數的NaH2PO4對蠶蛹多肽進行改性，進一步分析制備出的多肽結合鈣樣品中的鈣含量與磷含量，結果如表2。表2顯示：隨著NaH2PO4濃度不斷增加，蠶蛹多肽結合鈣中的磷含量不斷升高，但鈣含量隨著磷含量的升高呈先升高后下降的趨勢；當采用質量分數為0.50%的NaH2PO4作為磷酸化試劑時，多肽結合鈣中磷的質量分數為116.41 mg/g，結合鈣質量分數達到最大，為202.32 mg/g。

表2 NaH2PO4添加量對制得的蠶蛹多肽結合鈣中的鈣與磷含量的影響Tab.2 Effect of different addition of NaH2PO4 on content of calcium and phosphorus of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-caciam complex mg/g

結果表明，多肽磷酸化改性后可提高與鈣的結合率，但鈣結合能力并不與引入的磷酸基團呈正相關性，適宜程度的磷酸化水平更有利于多肽與鈣相結合。本研究結果與相關報道一致，如Jiang等[14]利用胰蛋白酶水解卵黃高磷蛋白后，用堿法脫磷將卵黃磷蛋白磷酸肽(PPPs)處理成17.5%～96.3%不同磷酸化程度的多肽，發現含35%磷酸化的PPPs對增強鈣結合能力和抑制不溶性磷酸鈣的形成是最有效的。

2.3 磷酸化改性對蠶蛹多肽結構的影響

2.3.1磷酸化位點檢測結果

磷酸化位點檢測結果見表3。表3顯示，蠶蛹多肽結合鈣中共鑒定出4個磷酸化位點，改性后，有17種肽段被磷酸化，增加磷酸化位點22個。磷酸化修飾主要發生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Try)兩種氨基酸上，磷酸化試劑能夠與 Ser和Try的—OH發生親核加成反應[15]，使磷酸基團接枝到多肽分子上，多肽再通過磷酸基團與Ca2+結合。

表3 磷酸化蠶蛹多肽結合鈣中磷酸化修飾的位點信息Tab.3 Phosphorylation sites of phosphorylated silkworm pupa polypeptide-calcium complex

2.3.2紅外光譜分析結果

圖2 不同質量分數的NaH2PO4處理制得的蠶蛹多肽結合鈣紅外光譜Fig.2 Infrared spectrum of silkworm pupa polypeptide binding calcium with different mass fraction of NaH2PO4

2.3.3磷酸化蠶蛹多肽的肽鈣結合模式分析

多肽主要通過磷酸基團和羧基等活性基團與鈣結合。酪蛋白經胃蛋白酶消化后生成酪蛋白多肽衍生物并被磷酸化，即生成CPPs，實際上是一系列含有磷酸絲氨酸簇的短肽-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-[18]。Ferraretto等[19]發現，CPPs核心序列上的磷酸絲氨酸殘基可與鈣結合形成Ca3(PO4)2納米團簇，從而聚集鈣離子并引起細胞對鈣的攝取。從動物體中制備出的具有促進鈣吸收作用的非磷酸化肽，主要通過所含谷氨酸(Asp)和天冬氨酸(Glu)上的羧基與鈣結合。Bao等[20]研究發現，大豆蛋白肽(SPHs)的鈣結合能力與羧基基團呈線性相關，并且最可能的鈣結合位點是Asp和Glu的羧基。蠶蛹中蛋白質含量約為12%～16%，具有良好的氨基酸配比，且Asp和Glu含量最高，分別可達到總氨基酸的10%和14%左右[21]，可提供豐富的肽- 鈣結合位點。Chen等[22]發現，鈣離子可通過單配位基模式、雙配位基模式和α模式與多肽結合。綜合磷酸化位點檢測結果和紅外光譜分析結果，推測磷酸化蠶蛹多肽的肽鈣結合模式如圖3。

圖3 磷酸化蠶蛹多肽的肽鈣結合模式Fig.3 Binding mechanism of calcium and phosphorylated silkworm pupa polypeptide

2.4 掃描電鏡分析結果

圖4為蠶蛹多肽、肽鈣復合物以及磷酸化改性后肽鈣復合物的掃描電鏡分析結果。由圖4可看出，蠶蛹多肽表面光滑，結構緊實；蠶蛹多肽結合鈣表面疏松多孔，與Wu等[23]制備的膠原多肽結合鈣類似，這種結構有利于溶解吸收；磷酸化處理后，其表面更加致密了，可能與其結合鈣含量較高有關。

圖4 多肽與肽鈣復合物的掃描電鏡分析結果Fig.4 Results of SEM analysis of peptide and calcium-peptide complex

3 結 論

本研究利用Na3PO4、NaH2PO4、(NaPO3)6等3種試劑對多肽進行磷酸化改性，再制備多肽- 鈣復合物。改性后多肽的鈣結合率顯著提高，且3種磷酸化試劑所制備樣品的鈣結合率無顯著性差異。選擇NaH2PO4為磷酸化試劑，蠶蛹多肽結合鈣中的磷含量隨著NaH2PO4添加量的增加而不斷升高，但鈣含量呈先升高后下降的趨勢。當NaH2PO4質量分數為0.50%時，磷含量為116.41 mg/g，結合鈣含量達到最大值，為202.32 mg/g。蠶蛹酶解產物中有17種肽段被磷酸化，增加磷酸化位點22個，主要是肽段中Ser、Thr的—OH與磷酸基團反應，從而增加與鈣離子的結合位點。

本研究開發了一種蠶蛹多肽的磷酸化改性方法，發現適宜程度的磷酸化水平的多肽結合鈣能力更強，希望該方法能夠應用于其他多肽材料中，為進一步開發出高效的補鈣制品提供理論參考和實踐指導。