中國傳統發酵食品研究現狀及前沿應用技術展望

陳 堅，汪 超，朱 琪，張 娟

(江南大學 未來食品科學中心/生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

發酵食品是指經過微生物(細菌、酵母和霉菌等)的發酵作用或經過生物酶的作用使加工原料發生重要的生物化學變化及物理變化后制成的食品。發酵食品以其低廉的價格，獨特的風味以及豐富的營養成為人們生活中必不可少的一部分。中國傳統發酵食品種類繁多，其原料同樣來源廣泛。根據原料的不同，中國傳統發酵食品主要可分為酒類食品，如白酒、啤酒、黃酒、葡萄酒等；谷類食品，發酵面食(饅頭、包子、馕、烙餅)、發酵米粉、酸漿面、醪糟、面醬等；豆類食品，如各種豆豉、腐乳、豆瓣醬、醬油、豆汁等；蔬菜類食品，如各種泡菜、腌漬菜等；水果類食品，如西瓜醬、山楂醬、果酒、果醋等；肉類食品，如金華火腿、臘肉、香腸等；水產類食品，如熏魚、臘魚、蝦醬、魚醬、魚醬油等；乳制品，如扣碗酪、奶豆腐、乳扇、酪干、奶卷、奶餑餑、酸奶等；其他類食品，如各種發酵茶(普洱茶、紅茶)等。

1 發酵食品生產過程特點

1.1 發酵工藝與環境復雜

1.2 混菌體系

傳統食品發酵微生物大多為混菌發酵體系，由于傳統發酵工藝的開放性與粗放性導致其微生物來源較為廣泛，主要來源于曲種、原料、發酵環境、生產工具等[2]，因此發酵微生物群落具有高度的多樣性和復雜性。原始的混菌體系經過特定發酵環境(溫度、pH值和養分等)的長期馴化，形成了穩定的由核心菌群主導原料轉化和風味形成的混菌體系，從而賦予發酵食品獨特的風味與營養。這個混菌體系相當于一個微型的工廠，每個微生物在獨立工作的同時也通過互作產生緊密的聯系。然而，在發酵生產的過程中，往往會出現原料轉化率低、風味生成不足、不良副產物伴生、對環境變化敏感等問題。為解決上述問題，必須透徹解讀傳統發酵食品的菌群結構及其演替規律，科學建立微生物與代謝物之間的聯系，篩選包括不可培養的功能微生物，解析微生物間的互作關系，最終通過添加功能微生物調控菌群或人工重組菌群來實現傳統發酵食品品質的提升和發酵工藝的升級。

1.3 經驗式的感官評定

食品發酵工藝較為復雜，需要定時監控發酵產品的重要指標，從而保證整個發酵過程能夠穩定有效地進行。目前，對相關指標的監測手段有限，且無法適配大批量、大規模的生產。因此，大多通過經驗豐富的工人對發酵產品的相關特性進行感官分析評定其發酵程度，并根據判斷結果調整發酵參數。因此，有必要對重要發酵指標進行量化，建立高效的檢測與監控系統。

2 發酵食品研究現狀

長期以來，人們對傳統發酵食品研究的最終目的都聚焦于風味與健康，期望通過研究解決發酵食品中特征風味、邪雜味、營養保健物質和抗營養因子相關的5個重要問題(4W1H)：1)什么物質(what)，即對影響食品品質的物質定性與定量；2)什么時間、哪個過程(when)，即確定目標物質產生的關鍵發酵時間節點；3)什么地方(where)，即確定目標物質產生的關鍵位置、關鍵生成條件和關鍵生成方式；4)誰是主要作用者(who)，即確定影響目標物質生成的關鍵微生物；5)如何調控(how)，即基于4W的結果通過強化或消除等方法改良發酵食品的風味或品質。

傳統方法對發酵食品的研究效率低、耗時長、投入精力大且研究不全面。隨著宏組學技術的興起，大量的基于組學技術的研究工作被投入到了傳統發酵食品的混菌體系研究之中。如對白酒酒醅[3-4]和大曲[5-14]、醋[10,15-17]、腐乳[18]、泡菜[19-20]、大醬[21-22]等傳統發酵食品的研究，內容涵蓋了微生物群落結構與演替規律的解析，微生物互作關系的初步探索，環境理化因子對菌群結構的影響評估，功能微生物、功能基因、新物種以及新基因的挖掘，核心菌群的確定等。其中Gan等[5]利用宏基因組與擴增子測序技術比較了發酵過程中形成的3種茅臺大曲的微生物群落組成與功能差異，揭示了大曲發酵過程中不同階段微生物結構的特征，加深了對微生物群落與大曲功能特性間關聯性的理解。Xie等[21]通過宏蛋白組學技術對傳統型與產品型北方大醬微生物功能比較，發現傳統型大曲的食品安全性更高，兩者在關鍵酶回溯的功能微生物結構上也具有差異。上述研究結果可為后續篩選功能微生物來優化大醬品質提供理論依據。Zheng等[3]結合宏蛋白組學技術、代謝組學技術與擴增子測序技術全面比較了30年和300年窖齡窖泥在酶系、物系與菌系結構上的差異，結果顯示300年窖齡窖泥具有更強的生香能力。Huang等[18]通過擴增子測序技術與代謝組學技術解析腐乳發酵過程中微生物群落演替規律與代謝物質的變化情況，并通過Pearson關聯網絡分析探究微生物與代謝物間的潛在聯系，這為腐乳發酵機制的研究提供了一定的參考。Wu等[17]運用宏基因組學與代謝組學技術構建了鎮江香醋發酵過程中關鍵物質的代謝通路并闡釋了微生物在不同芳香物質形成過程中的作用。該類研究既為傳統食品發酵機制的解析提供了理論依據，也為傳統發酵食品品質的改良提供了科學指導。

3 發酵食品前沿應用技術

將基因工程、合成生物學、分子生物學等前沿生物技術應用于傳統發酵食品的生產中，能有效地定向改良發酵食品的風味感官，增加其營養成分以及消除抗營養分子，同時能維持發酵食品品質的長期穩定性。例如應用合成生物學使工業釀酒酵母合成單萜分子芳樟醇和香葉醇，在啤酒中形成更令人愉悅的啤酒花風味，而不用添加啤酒花[23]。

3.1 人工感知技術的應用

隨著感知科學基礎研究的快速發展，如酸味受體被鑒定，同時確定了酸甜苦咸鮮5種味道的神經元結構[24]，研究表明：酸味使用舌頭專用的味覺受體細胞(TRC)，以精細調節大腦中的味覺神經元觸發厭惡行為，使得人工感知器官可能被實現模擬和應用。

雖然人工智能技術進行風味物質的挖掘、組合，實現人工感知器官(電子眼、電子鼻、電子舌)模擬研究還處于初級階段。只能實現對現有產品有效分類，但無法指出樣品間的物質、感官差異。但技術的迭代日新月異，不久的將來人工感知器官將得到更加廣泛的應用。如同生物傳感器的發展經歷了從“酶電極” “酶、免疫、微生物傳感器” “細胞傳感器” “組織傳感器” “生物芯片”到“多功能傳感器”的演變。

Although phosphor particles are small, the initial and final settling velocities are not significantly different, hence acceleration can be ignored. When the particles are stable or settling down, f can be expressed as:

運用智能感官等技術進行食物感知、物質分析、仿生傳感、感官評價、消費者分析。如運用計算機視覺模仿視覺觀察食物外觀特征，運用電子鼻模仿人體嗅覺器官嗅出食物香味，應用機械嘴模擬吃食物過程，應用機械觸覺模擬手指觸覺，對食物軟硬度流動性等質構情況提供信息等技術。通過數據學習、訓練，輸出食品的多感官特性描述，如產品的消費者情感影響、產品與消費者目標差異等。

3.2 發酵食品微生物新技術的應用

隨著一批將對生物技術產業產生巨大影響的技術出現與高速發展，我們能結合多元化的手段對關鍵發酵微生物進行定向化篩選與改造，獲得傳統方法難以篩選到的功能微生物，包括不可培養的功能微生物，編輯關鍵微生物遺傳信息，創建全新的、高效的微生物群落，從而賦予整個微生物細胞工廠更高的發酵智慧。例如，可使微生物擁有原料自識別和高利用能力、風味物質代謝的適度自控、營養物質高積累和抗營養因子生物降解能力，以及復雜環境自適應和不良條件的強抵御能力等。

3.2.1微生物的快速精確定量技術

目前，解讀傳統發酵食品混菌體系的組學技術已較為成熟，但組學技術只能對微生物進行相對定量且無法區分死菌與活菌數，然而想要解析微生物與目標代謝物間的關聯性則需要了解相關活性功能微生物在發酵過程中絕對量的變化，因此有必要結合前沿生物技術構建快速的發酵食品活性微生物的快速精確定量技術。目前，發酵食品的微生物定量檢測方法的對比見表1。

表1 發酵食品微生物絕對定量技術Tab.1 Absolute quantification methods of microorganisms in fermented food

3.2.1.1 EMA/PMA-qPCR技術

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)是一種在DNA擴增反應中通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測，由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據，通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。魏娜等[25]利用qPCR對濃香型白酒不同窖齡窖泥微生物區系特定種群的快速定量檢測，再進一步結合代謝產物指標可用于窖池中難培養微生物種群的功能分析和評定；李鳳珠等[26]基于qPCR建立一種準確定量榨菜腌制過程中細菌和真菌數量的方法。

但普通的qPCR只能反應目標微生物總的拷貝數，無法區分死、活微生物的數量。EMA/PMA-qPCR 活菌檢測技術是利用新型核酸染料疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide，EMA)或疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)滲入膜損傷的細胞后，與雙鏈 DNA 或 RNA 發生非可逆的共價結合，從而抑制膜損傷細胞DNA 在 PCR 反應中的擴增，使 qPCR 反應結果只反映活細胞 DNA 含量[27]。蓋冬雪[28]采用PMA-qPCR對乳制品樣品中活菌DNA進行定量,分別建立一種快速檢測巴氏乳中細菌與發酵乳中酵母菌活菌總數的檢測方法。段亮杰等[29]利用 PMA-qPCR 法快速、準確地檢測黃酒釀造過程中 5 種乳桿菌的活菌數，為解析樣品中乳桿菌的實時組成及檢測具有活性但不可培養(viable but nonculturable，VBNC)狀態的乳桿菌提供了可靠的手段。Lü等[30]對與紅曲糯米酒傳統釀造有關的主要微生物的PMA-qPCR參數進行了標準化并成功將優化的PMA-qPCR方法應用于紅曲糯米酒的傳統釀造過程中總細菌，總真菌，酵母菌，釀酒酵母和植物乳桿菌等微生物數量的監測。

3.2.1.2 流式細胞術

流式細胞術(flow cytometry)是20世紀60年代后期開始發展起來的利用流式細胞儀(flow cytometer)快速定量分析細胞群的物理化學特征及根據這些物理化學特征精確分選細胞的技術，主要包括流式分析與流式分選兩部分[31]。它可以高速分析上萬個細胞，速度快、精度高、準確性好，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。近年來，流式細胞術被廣泛應用于食品微生物的檢測。黃韻[27]采用流式細胞術對冷鮮肉中的具有VBNC狀態的單增李斯特菌進行定量檢測，經研究發現，流式細胞術相對于平板計數法和PMA-qPCR定量能夠更加快速且精準地檢測食品中的致病菌。Malacrino等[32]利用流式細胞術對葡萄酒中的酵母與蘋果酸- 乳酸菌同時進行快速有效的定量。Conacher 等[33]通過流式細胞術對合成酵母菌群系統中微生物數量的動態變化進行實時監控。

3.2.1.3 CRISPR-Cas12a耦合熒光探針系統

隨著分子技術的發展，出現了一批新興方法，例如基于CRISPR-Cas12a耦合熒光探針系統，可實現快速、簡便、準確的特異性微生物定量[34]，在食品微生物檢測方面有著巨大的潛力。通過優化熒光強度響應的動態范圍，強化微生物種類檢測的特異性，開發微生物檢測試紙，食品微生物檢測有望實現實時定量快速檢測，為混菌發酵過程監控與食品安全檢測提供有力工具[35]。

3.2.2人工合成技術

傳統發酵食品中的原生混菌系統具有復雜、穩定性差和功能冗余等缺陷，會造成原料轉化的低效和不良副產物的生成，同時也會增加發酵產品品質和風味的波動性。實現功能菌群的人工合成(組裝與調控)，將有助于解決風味、安全與健康等問題。

3.2.2.1 人工重組菌群

人工重組菌群有助于在模擬環境中實現傳統發酵食品風味的重現。為實現人工菌群的選擇與重組，首先需要在多組學聯用分析研究的基礎上，探究傳統發酵食品的微生物群落結構及其演替規律，通過酶系、菌系和物系間的互作關系解析核心功能菌群。在此基礎上，評估影響菌群的生物因子與非生物因子，并通過模擬發酵分析重組菌群的最佳結構比例[36]。Wang 等[4]運用擴增子測序技術結合代謝組學技術解析白酒發酵過程中的核心微生物菌群，并通過人工合成菌群重現白酒發酵，這對發酵食品的可操作性和連續性生產具有重要意義。

3.2.2.2 人工調控菌群

通過添加功能微生物調整菌群結構，可以使其擁有更強的原料轉化效率、風味合成能力以及有害物質的降解能力[37]。傳統生態系統中具有微生物演替和環境變量的自然發酵，導致發酵食品品質存在波動性。He等[6]提出了定向微生物擾動，用于食品發酵中微生物群的調控和目標產物的增加。通過接種Bacillusvelezensis和Bacillussubtilis調整大曲菌群結構來強化大曲功能。結果表明：強化大曲的生物擾動明顯影響了微生物群落，增加了己酸菌、梭菌、曲霉、念珠菌、甲烷菌和甲烷菌的豐度，降低了乳酸桿菌的豐度。共現分析表明：生物擾動增加了微生態系統中物種間相互作用的多樣性和復雜性，從而促進了風味代謝產物(如己酸，己酸乙酯和己酸己酯)的生成。這些結果表明：通過功能菌群的種間相互作用，強化大曲的生物擾動對于風味代謝的促進是可行的[38]。人工調控菌群對于提升中國白酒以及其他發酵食品的品質至關重要。

3.3 發酵食品感知新技術的應用

深入探索發酵食品感知技術，研究食品的感官特性和消費者的感覺，探究感官交互作用和味覺多元性，解析大腦處理化學和物理刺激過程從而實現感官模擬，理解感官的個體差異，多學科交叉進行消費者行為分析，評估感官、消費者的方法學[39]。構建“發酵+食品+神經生物學+大數據”的系統化研究體系。

3.3.1基于神經生物學的發酵調控

如找出發酵產品中風味的關鍵物質成分，了解其造成食用后舒適、不適的機制，確定干預措施，提升產品食用后的舒適度。構建初舒適度模型及理論，建立動物模型，確定舒適度指標。厘清舒適度的標志物和機理，開展行為學、體外腦組織培養高通量篩選技術、生化和生理學實驗。進而開展人體測試、轉化研究。

3.3.2基于大數據的風味網絡技術

風味化合物不等于風味，不同種類和比例甚為重要；因為人工難以及時處理多類信息、實現全局優化，需要依靠大數據和人工智能技術建立風味網絡；解決風味問題，優化已有風味，預測可能風味，開發新型風味及風味食品。

4 結 語

發酵微生物更智慧、發酵過程更智能、發酵產品更美味是新時代發酵食品技術的追求。未來，應以改善中國傳統發酵食品為抓手，進一步加速開發發酵食品的關鍵共性技術、現代工程技術、前沿引領技術和顛覆性技術,推動我國整體食品發酵產業的創新式發展，引領世界食品發酵產業的發展迭代。