白玉蘭根圍細菌及菌根真菌遺傳多樣性分析

何小麗

(1.上海市園林科學規劃研究院，上海 200232； 2.上海城市困難立地綠化工程技術研究中心，上海 200232)

玉蘭，為木蘭目、木蘭科、木蘭屬落葉喬木，常見種類有白玉蘭、望春玉蘭、二喬玉蘭、紫玉蘭等，為中國著名花木，是早春重要的觀花樹木，有著兩千多年的栽培歷史。玉蘭喜溫暖濕潤氣候和肥沃疏松土壤，不耐干旱和水澇，現多見于園林或行道樹兩側。白玉蘭為上海市市花，上海氣候濕潤多雨，植物根圍土壤中分布著大量的微生物，根圍微生物和植物互生互利，植物為根圍微生物提供碳源、氮源及其他營養物質，根圍微生物幫助植物更好的吸收土壤中的礦質營養并提供大量促進植物生長的激素等物質，同時由于占據有效生態位，也具有有效防御病原菌侵害等作用。根圍微生物中的菌根真菌與植物關系緊密，據估計，3%的植物都會形成菌根結構[1-2]。浙江嵊州作為全國著名的玉蘭繁殖基地，本研究對浙江嵊州白玉蘭林進行土樣采集，分析其根圍細菌群落及菌根真菌多樣性，為了解白玉蘭根圍微生物群落結構打下基礎，從而為白玉蘭的推廣應用提供有效的科學支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

共采集浙江嵊州1～4號白玉蘭林不同深度(0～30、30～60 cm)土壤樣品7個，分別編號為1-30、1-60、2-30、2-60、3-30、4-30、4-60。3號樣地由于土壤硬且雜質較多，只取0～30 cm土樣，編號3-30(表1)。

表1 各白玉蘭根圍土樣的理化性質

1.2 土壤微生物DNA提取及MIseq測序

稱取250 mg的樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL 70%乙醇，震蕩混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上層液體。加入1×PBS溶液，震蕩混勻，10 000 r·min-1室溫離心3 min，棄上層液體。倒置2 mL離心管于吸水紙上1 min，直至沒有液體流出。將樣品管于55 ℃烘箱放置10 min，使殘留酒精完全揮發。具體提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用說明書。使用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

采用通用引物(341F/805R)對土樣細菌16S rDNA基因的V3～V4區進行擴增，采用菌根特異性引物(AMV4.5NF/AMDGR)[3]對土樣菌根真菌18S rDNA基因進行擴增。PCR擴增體系為50 μL，其中含2×Taq master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol)1 μL、Primer R(10 μmol)1 μL、Genomic DNA 10～20 ng、H2O 補齊至50 μL。PCR擴增的反應條件為：94 ℃ 3 min；5×(94 ℃ 30 s；45 ℃ 20 s；65 ℃ 30 s)；20×(94 ℃ 20 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。PCR擴增產物利用上海生工生物工程有限公司的MiSeq PE300測定儀(Illumina Inc.San Diego.CA.USA)完成序列測定。

1.3 數據分析

將測序所得全部有效的基因序列以97%的一致性聚類得到OTUs序列，通過RDP classifier軟件對所有OTUs序列進行序列比對得到其系統發生關系。

2 結果與分析

2.1 白玉蘭林土壤細菌多樣性

1～4號地塊的白玉蘭林土壤細菌香農多樣性指數均在6左右(表2)。其中，1、2號地塊不同深度土壤細菌香農多樣性指數表現為表層0～30 cm高于深層30～60 cm土壤，4號地塊細菌香農多樣性指數表現為表層0～30 cm與深層30～60 cm土壤差異不顯著。

表2 各白玉蘭根圍土樣的細菌多樣性指數與豐度

不同地塊白玉蘭土壤細菌物種相對含量平均值大于1%的主要為Unclassified(37.5%)、Gp2(6.1%)、Gp1(5.6%)、Gp3(2.6%)、Rhizomicrobium(2.5%)、Phenylobacterium(2.1%)、Ktedonobacter(2.1%)、Arthrobacter(1.7%)、Burkholderia(1.2%)、Gemmatimonas(1.3%)、Sphingosinicella(1.3%)、Pseudomonas(1.2%)(圖1)。不同地塊不同深度土壤細菌群落結構有所差異，1-30、1-60、2-30、2-60中GP2、GP1相對豐度較高；3-30優勢種類Phenylobacterium相對豐度較高；4-30、4-60優勢種類GP2、GP1、GP3、Rhizomicrobium相對豐富較高。上述結果可知，由于GP2、GP1、GP3等種類名稱還未確定，其功能也就難以被深入研究，有待后期進一步的研究。

圖1 各白玉蘭根圍土樣細菌群落在屬水平上的組成和相對豐度

2.2 白玉蘭根圍細菌群落環境影響因子分析

速效鉀AK與第一排序軸高度相關，是白玉蘭根圍細菌群落主要環境影響因子，堿解氮AN、有效磷AP、有機質OM、pH和第二排序軸高度相關，為白玉蘭根圍細菌群落次要環境影響因子。其中1、2號地塊細菌群落與pH正相關，3號地塊細菌群落與AK正相關，4號地塊細菌群落與OM、AN、AP和EC值正相關(圖2)。

圖2 白玉蘭根圍細菌群落與土壤理化因子的典型對應分析

2.3 白玉蘭林菌根真菌多樣性

1～4號地塊中1-30樣品土壤菌根真菌香農多樣性指數最高，為4.60，高于其他6個樣品(表3)。其中，1、2號地塊不同深度土壤菌根真菌香農多樣性指數表現為表層0～30 cm高于深層30～60 cm土壤，這與其細菌多樣性指數一致；4號地塊菌根真菌香農多樣性指數表現為與其細菌多樣性指數變化保持一致。

表3 各白玉蘭根圍土樣的菌根真菌多樣性指數與豐度

在屬的分類水平上，不同地塊白玉蘭土壤菌根真菌物種主要為unclassified(45.9%)、Umbelopsis(19.6%)、Geminibasidium(6.0%)、Aphelidium(4.1%)、Knufia(2.4%)、Thanatephorus(2.3%)、Aspergillus(1.7%)、Venturia(1.6%)、Powellomyces(1.6%)、Fimicolochytrium(1.3%)、Xylobolus(1.2%)。不同地塊不同深度土壤菌根真菌群落結構差異較大，1-30中Geminibasidium、Knufia、Rigifila占有較高比例，分別為6.0%、7.3%、5.5%；1-60中Aphelidium、Knufia、Fimicolochytrium、Xylobolus占有較高比例，分別為24.5%、8.9%、8.2%、7.0%；2-30、3-30中未分類細菌平均占80%，表明其中含大量潛在的新種；2-60中Geminibasidium、Thanatephorus、Venturia、Powellomyces占有較高比例，分別為31.9%、13.5%、8.1%和5.0%(圖3)?？梢钥闯?號白玉蘭林4-30、4-60土壤中Umbelopsis為主要的優勢種群，相對豐度分別占65.8%、69.3%，遠高于其他5個土壤樣品。

圖3 各白玉蘭根圍土樣菌根真菌群落在屬水平上的組成和相對豐度

3 小結與討論

土壤根圍細菌和菌根真菌對植物生長影響顯著，但由于土壤微生物及菌根真菌研究方法的局限性，園林植物根圍細菌及其菌根真菌分布特征研究報道較少，且多集中在常見的花卉植物。本研究發現，浙江嵊州1～4號白玉蘭林根圍細菌群落結構較相似(3號林除外)。1～4號白玉蘭菌根真菌群落差異較大，其中4號白玉蘭林菌根真菌以Umbelopsis為主要優勢菌，且與矮小傘霉菌(Umbelopsisnana)的相似度達99%。很多學者也從其他植物中分離到傘狀霉屬，如趙建娜[4]從蘭科植物根部分離到傘狀霉屬等菌根真菌；羅開源[5]從銹葉杜鵑根部分離到傘狀霉屬真菌；楊鶴同[6]從鐵皮石斛根部分離到傘狀霉屬真菌。研究表明，Umbelopsis并不是白玉蘭的專一性菌根真菌[7-8]，通常可以將植物促生菌制備成菌劑促進植物生長[9-10]，因此，可以通過添加外源菌根真菌Umbelopsis菌劑以提高白玉蘭林土壤菌根真菌含量，從而間接提升白玉蘭林的生長狀態。從白玉蘭長勢來看，4號地塊白玉蘭長勢最佳，優于1～3號地塊白玉蘭。1～4號地塊白玉蘭土壤菌根真菌群落結構差異明顯，且無共同的優勢菌根真菌，只有1-60、2-60中的Aphelidium、Geminibasidium占有較高比例，分別達24.5%、31.9%；1～3號地塊主要為粗放式管理的白玉蘭林，人工干預小，4號地塊為基地栽植，人工精細化管理，肥水措施完善，4號地塊土壤肥力明顯高于1～3號地塊，這些綜合因素可能導致4號地塊與其他地塊菌根真菌群落不同。綜合分析表明，土壤肥力的提升對白玉蘭菌根真菌遺傳多樣性的影響較大，但對細菌遺傳多樣性影響較小，可以通過改變白玉蘭菌根真菌群落結構來提升白玉蘭林生長效果。本研究對浙江嵊州地區白玉蘭林地開展研究，研究結果為上海市白玉蘭的培育與管護提供借鑒意義。對上海地區白玉蘭根圍細菌及其菌根真菌群落有待開展進一步對比研究。