靈芝菌種液氮保藏工藝分析

謝航，林娟

(福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350108)

靈芝是我國著名的食藥用菌，在我國系統描述的種類有103個種[1]，其中靈芝(Ganodermalingzhi)原稱為赤芝(Ganodermalucidum)是我國靈芝屬的主要種類[2]，其干燥子實體被作為法定的中藥材收錄于《中華人民共和國藥典》當中。目前有關靈芝類的研究已逐漸成為熱點，然而多數的研究者專注于靈芝的分類鑒定[3-5]、藥理作用[6-8]、有效物質[9-11]、基因組和基因功能[12-15]等，而忽視研究菌株的穩定性、基因完整性的安全長期保藏，一旦由于管理或保藏技術的原因，致使菌株丟失、變異、退化，將很難持續開展后期的研究，因此，菌種的保護工作顯得尤為重要。

菌種保藏的方法很多，對于食藥用菌，液氮保藏是一種公認的、長久有效的保藏方法[16-17]，然而陳燕妍在對擔子菌菌種24屬43種122株進行液氮保藏時發現，靈芝屬的菌株有較明顯的失活[18]，顧金剛也指出，菌種進行液氮保藏需要對其進行優化才能得到較好的保藏效果[16]。鑒于此，本文以靈芝菌種為材料，對影響液氮保藏效果的降溫速率、保護劑濃度、解凍溫度、培養基質和菌餅大小等方面進行系統研究，以期掌握靈芝菌種的液氮保藏技術，使之在靈芝種質資源的保藏中得到更好地應用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

靈芝芝120由福建省食用菌種質資源保藏管理中心提供。

1.2 培養基

培養基1(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

培養基2：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

培養基3：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，棉籽殼30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

培養基4：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，木屑30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

其中馬鈴薯、棉籽殼和木屑需要經過熱沉提后過濾。

1.3 主要儀器

恒溫培養箱(SHP-250型，上海精宏實驗設備有限公司)，超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，手提式高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS18SI型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠)，Cryo GenesisTMV5程序降溫儀(廣州倍瑪特儀器設備有限公司)，恒溫水浴鍋(HH-US-A，上海赫田科學儀器有限公司)，液氮罐(YDS-30，山東博科科學儀器有限公司)

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種培養與保藏管制作

靈芝芝120接種于PDA培養基，28 ℃下恒溫培養，待菌絲覆蓋至直徑9 cm平皿的四分之三時，用6 mm打孔器均勻取菌餅，轉移至冷凍管中，注入已滅菌的10%甘油，靜置過夜。

1.4.2 降溫程序設計

試驗設9個降溫處理和1個不經降溫處理液氮保藏，程序降溫在程序降溫儀上進行，每個程序5個重復，同時采用30 ℃水浴解凍處理。

程序設計方案見表1，試驗以靈芝菌種萌發時間、萌發率與萌發速度為指標，篩選出最優降溫程序設計。

表1 液氮保藏降溫處理

1.4.3 不同保藏培養基試驗

靈芝芝120菌種分別用1.2中的4種培養基培養，待菌絲培養好，用6 mm打孔器取菌餅，每種培養基5個重復，采用最優降溫程序處理。

1.4.4 不同菌餅大小試驗

采用PDA培養基培養菌種，分別采用4 mm、6 mm和8 mm打孔器取菌餅，不同大小的菌餅各5個重復，采用最優降溫程序處理。

1.4.5 不同甘油濃度試驗

采用PDA培養基培養菌種，用6 mm打孔器取菌餅后，以甘油作為防凍劑，設置甘油與蒸溜水體積比為0%、5%、10%、15%和20% 5個梯度，分別注入到冷凍管中，每個甘油濃度5個重復，采用最優降溫程序處理。

1.4.6 不同解凍溫度試驗

菌種在液氮罐內保藏2個月后，設置25、30、35和40 ℃恒溫水浴解凍處理，每個解凍處理5個重復。

1.4.7 保藏效果評價方法

取出液氮保藏2個月后的靈芝菌種，經解凍后，接種于PDA培養基上，每個處理5個重復，28 ℃恒溫培養，記錄菌絲萌發時間，測量生長速度，觀察菌落特征，分析其保藏效果。

2 結果與分析

2.1 不同降溫處理對靈芝菌種保藏影響

靈芝芝120菌種經不同降溫處理后，其萌發時間、萌發率和生長速度存在差異(表2)。芝120菌種經程序9和程序10處理后，萌發率分別為80%和60%，菌種出現死亡現象，其萌發時間滯后，并且生長速度較慢，表明芝120菌種經這2種程序處理后受到較嚴重的損傷。程序1～8處理靈芝菌種后，雖然菌種均能100%萌發，但萌發時間與生長速度的差異也較大，其中程序1、程序5和程序8處理的靈芝菌種萌發最快，為2 d，且生長速度也處于最快的梯隊，超過0.7 cm·d-1。而程序2與程序7處理的靈芝菌種的萌發時間延長至5 d，生長速度也較慢，與經程序1、5、8處理后的生長效果相比達到極顯著差異。

表2 降溫處理對靈芝菌種液氮保藏的影響

根據程序1、5、8的特點，發現從4 ℃降至-40 ℃時，以每分鐘1 ℃的速率進行降溫，靈芝菌種的保藏效果優于程序2、6、7、9中采用的每分鐘4 ℃或9 ℃。這表明靈芝菌種采用液氮保藏時，從4 ℃降至-40 ℃時的降溫速度不宜太快。

2.2 不同培養基對靈芝菌種保藏影響

從表3可以看出，4種不同培養基培養的靈芝菌種，經液氮保藏后，在萌發時間和萌發率上并無差異，但生長速度存在顯著差異。以培養基4培養的靈芝菌種，保藏后的靈芝菌種生長速度最快，其次是培養基3。這表明培養基對靈芝菌種的液氮保藏效果有影響。

表3 培養基對靈芝菌種液氮保藏影響

2.3 不同菌餅大小對靈芝菌種保藏影響

菌餅大小試驗(表4)可以看出，靈芝菌種經適宜的程序降溫處理后進行的液氮保藏，3種菌餅大小的靈芝菌種在萌發時間和萌發率無差異，但生長速度是隨著菌餅增大而加快，這說明菌餅的大小將影響靈芝菌種保藏后的生長速度。

表4 菌餅大小對靈芝菌種液氮保藏影響

2.4 防凍劑濃度對靈芝菌種保藏影響

在低溫冷凍保藏中，一般都需要添加防凍劑來提高菌種保藏的活力。從表5可看出，不加甘油作為防凍劑的靈芝菌種在液氮保藏后萌發率僅為60%，且所需的萌發時間最長。而不同濃度的甘油對靈芝菌種的液氮保藏效果在萌發率和生長速度上未體現顯著差異；但從萌發所需時間看，以15%甘油為保護劑所需的萌發時間為1 d，而20%甘油的萌發時間延長至3 d。這表明靈芝菌種在液氮保藏時需要添加一定濃度的保護劑有助于提高其存活率，但添加濃度不宜過高。

表5 甘油濃度對靈芝菌種液氮保藏影響

2.5 不同解凍溫度對靈芝菌種保藏影響

靈芝菌種經液氮保藏后，在4種不同溫度下進行解凍復蘇，均可以100%存活，萌發時間差異小，但是萌發后的生長速度存在顯著差異(表6)。其中靈芝菌種經35 ℃解凍后的生長速度相對快，且菌絲濃密；而25 ℃和40 ℃解凍的菌種生長速度慢，生長的整齊性較差，表明靈芝菌種在25 ℃和40 ℃下解凍后的菌種活力受到影響。

表6 解凍溫度對靈芝菌種液氮保藏影響

3 小結與討論

在液氮保藏中涉及多種因素，因此，找到最優的工藝是進行液氮保藏的核心。以往降溫處理過程中，真菌一般常用的程序是以每分鐘1 ℃降溫至-30～-40 ℃，然后迅速放入液氮中[16-18]。本文對靈芝菌種的降溫程序進行優化時也發現，在4～-40 ℃時，以每分鐘1 ℃速率進行降溫，菌種的活力最高，但在常溫降至4 ℃，卻是以每分鐘4 ℃或9 ℃的效果最好。而劉新銳等[19]在采用相同降溫程序對香菇菌種進行液氮保藏時，復蘇后的菌種生長速度無差異，這可能是不同種類食藥用菌本身的特性差異引起的。

同時，保藏基質的選擇是液氮保藏工作中的一個重要因素[17]。靈芝菌種在不同的培養基下，其生長狀態表現出差異[20-21]，也影響靈芝菌種的液氮保藏效果。本文研究發現，在PDA培養基中添加木屑浸出液作為靈芝菌種保藏培養基，復蘇后的菌種活力最好，而且保藏的菌餅直徑越大，復蘇后的活力也越高，這都可能與菌餅所含的營養物質有關。

保護劑是超低溫菌種保藏中必須添加的，一般常用的有甘油和二甲亞砜。由于二甲亞砜在一些條件下會對真菌產生毒害，因此，在食藥用菌中通常選擇10%甘油作為保護劑[17]。本文研究發現，添加15%甘油的效果也很好，這與香菇保藏實驗結論不一致。可能是由于甘油除了作為保護劑外，其本身也是碳水化合物[22]，靈芝菌種可利用其作為營養物質。所以即使甘油濃度達到20%時，影響萌發時間，但生長速度與添加10%和15%甘油的無差異。

靈芝雖然屬于高溫性菌類，但適宜的生長溫度是28 ℃，溫度過高將抑制其生長[23]。保藏后多數采用38～40 ℃進行快速解凍[17-18]，本文采用40 ℃快速解凍液氮保藏后的靈芝菌種，發現其復蘇后的活力明顯受到抑制，這表明即使是短時高溫也對靈芝菌種的活力產生影響。因而靈芝菌種在液氮保藏后的解凍溫度不宜超過35 ℃。

通過本文的研究，得到較優的靈芝菌種液氮保藏工藝為：采用每分鐘4 ℃或9 ℃從室溫降溫至4 ℃，后以每分鐘1 ℃降溫至-40 ℃；采用添加木屑浸出液的PDA作為培養基；取菌餅8 mm大小；注入10%～15%甘油進行液氮保藏；在35 ℃水浴快速解凍。由于菌種保藏是一項長期工作，本文僅從成活率、萌發時間和菌絲生長速度對靈芝菌種的液氮保藏效果進行初步評價，還需經過更長保藏時間和其他性狀的檢測，這有待后續進一步研究。