長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體的人工誘導(dǎo)

李永國(guó) 李 琪, 于瑞海

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 青島 266003; 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室, 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室, 青島 266237)

長(zhǎng)牡蠣(Crsssostrea gigas)又稱太平洋牡蠣, 是我國(guó)北方主要的牡蠣養(yǎng)殖品種, 由于其具有生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)以及肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn), 已成為世界上養(yǎng)殖范圍最廣的經(jīng)濟(jì)貝類之一。2017年, 我國(guó)牡蠣產(chǎn)量487.9×107kg[1], 占全國(guó)貝類產(chǎn)量34.0%, 全國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)量24.4%, 牡蠣養(yǎng)殖在我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)中占有十分重要的地位。

目前, 我國(guó)北方養(yǎng)殖的長(zhǎng)牡蠣大多為二倍體,上市季節(jié)主要集中在10月至次年3月。二倍體長(zhǎng)牡蠣4月以后開始進(jìn)入性成熟期, 隨配子的發(fā)育體內(nèi)糖原大量消耗, 肉質(zhì)變差; 夏季進(jìn)入產(chǎn)卵期后, 軟體部變得消瘦, 往往無(wú)法供應(yīng)市場(chǎng)[2]。而長(zhǎng)牡蠣三倍體在夏季性腺發(fā)育程度較低, 幾乎不育[3], 可以填補(bǔ)二倍體長(zhǎng)牡蠣夏季市場(chǎng)的短缺, 實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)牡蠣的全年供應(yīng), 近年來備受產(chǎn)業(yè)的關(guān)注。此外, 三倍體長(zhǎng)牡蠣具有生長(zhǎng)速度快[4,5]、肉質(zhì)好[6]及部分抗病能力[7]等優(yōu)點(diǎn), 因此開展長(zhǎng)牡蠣三倍體良種的培育對(duì)于促進(jìn)牡蠣產(chǎn)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要意義。

長(zhǎng)牡蠣三倍體有2個(gè)主要的獲得途徑。一是由長(zhǎng)牡蠣二倍體通過物理或化學(xué)處理誘導(dǎo)三倍體, 但是存在存活率低、成本較高、三倍體率不穩(wěn)定以及難以自群繁育來穩(wěn)定獲得三倍體等問題; 二是先獲得長(zhǎng)牡蠣四倍體, 然后和長(zhǎng)牡蠣二倍體雜交來獲得100%三倍體[8], 而且四倍體可以通過自群繁育來擴(kuò)大種群, 為長(zhǎng)牡蠣三倍體的商業(yè)化生產(chǎn)提供四倍體親本保障。根據(jù)卵子的來源不同, 獲得長(zhǎng)牡蠣四倍體的方法可以分為2種, 一種是抑制長(zhǎng)牡蠣二倍體受精卵第一極體釋放誘導(dǎo)牡蠣四倍體[9,10], 另一種是先獲得長(zhǎng)牡蠣三倍體, 再利用三倍體牡蠣的卵子和二倍體牡蠣的精子授精, 并抑制其第一極體釋放來誘導(dǎo)四倍體[11]。前者不需要三倍體親本, 且育種周期相對(duì)較短。適宜的誘導(dǎo)條件是獲得長(zhǎng)牡蠣四倍體的關(guān)鍵, 在使用細(xì)胞松弛素B(CB)誘導(dǎo)貝類四倍體的過程中, CB濃度[10]、起始誘導(dǎo)時(shí)間[12]和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間[13]是3個(gè)影響誘導(dǎo)結(jié)果的重要因素。很多研究往往只研究了其中1個(gè)因素對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣四倍體的影響, 2個(gè)或者3個(gè)因素及其交互作用對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣四倍體的影響鮮有報(bào)道。

長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”是從長(zhǎng)牡蠣野生群體中篩選左殼色為金黃色個(gè)體構(gòu)建基礎(chǔ)群體, 以金黃殼色和生長(zhǎng)速度作為選育目標(biāo)性狀, 采用家系選育和群體選育相結(jié)合的混合選育技術(shù)選育而成。其左右殼和外套膜均為色澤亮麗的金黃色, 大大提高其商品價(jià)值[14], 而且生長(zhǎng)速率顯著高于未經(jīng)選育的長(zhǎng)牡蠣,在山東和遼寧等地取得了良好的養(yǎng)殖效果。本研究以長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”二倍體為研究對(duì)象, 探討了CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體的影響, 以期篩選出長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體適宜誘導(dǎo)條件, 為培育長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實(shí)驗(yàn)親貝為2齡的長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”二倍體, 殼高(89.37±8.74) mm, 濕重(61.37±12.42) g, 取自山東榮成桑溝灣養(yǎng)殖海區(qū), 并于萊州市長(zhǎng)漁水產(chǎn)有限公司進(jìn)行室內(nèi)人工促熟至性腺成熟。解剖獲取精子和卵子, 授精前檢查卵子熟化程度, 并確認(rèn)卵子無(wú)精子污染。把精卵混合時(shí)刻作為受精的零時(shí)刻。

1.2 四倍體誘導(dǎo)與幼蟲和稚貝的培育

為探討CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體的影響及篩選適宜的四倍體誘導(dǎo)條件, 分別設(shè)置4個(gè)CB濃度梯度(0.3、0.5、0.7和0.9 mg/L)、3個(gè)起始誘導(dǎo)時(shí)間梯度(10、15和20min)及4個(gè)誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間梯度(10、15、20和25min), 共48個(gè)處理, 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)使用海水鹽度為32, 處理過程中控制水溫為24℃。在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制時(shí)間, 在誘導(dǎo)處理完成后, 立即用1000目篩絹收集并用砂慮海水充分沖洗, 然后將其轉(zhuǎn)移到含有1 mL/L DMSO(二甲基亞砜)的砂濾海水中, 30min后用篩絹過濾, 并用砂慮海水充分沖洗后轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)桶中孵化。8h后固定幼蟲樣品材料, 用于染色體計(jì)數(shù)。24h后統(tǒng)計(jì)D形幼蟲率, 并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)幼蟲倍性。其中, D形幼蟲率為所有D形幼蟲占受精卵的百分比。

為檢測(cè)誘導(dǎo)方法的有效性, 將3個(gè)誘導(dǎo)處理組的幼蟲轉(zhuǎn)移到水泥池進(jìn)行養(yǎng)成, 日常管理過程同普通二倍體牡蠣幼蟲的培育過程。附著后, 將稚貝轉(zhuǎn)移到山東榮成桑溝灣養(yǎng)成。

1.3 四倍體的倍性鑒定

流式細(xì)胞儀分析: 流式細(xì)胞儀可以快速判斷早期幼蟲群體的倍性組成以及確定個(gè)體的倍性。取受精24h后的幼蟲于離心管中, 加入1 mL 1×PBS(Phosphate buffered saline)緩沖液, 用1.5 mL注射器吸打后, 300目篩絹過濾, 75%乙醇固定, 4℃保存過夜。離心(300×g)后倒掉上清液, 加入1 mL 1×PBS,再加入20 ng/mL RNA酶A反應(yīng)30min后, 最后再加入35 μL的PI(1 mg/mL)染色30min, 經(jīng)300目篩絹過濾后, 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。180日齡時(shí), 取幼貝鰓絲再次進(jìn)行倍性檢測(cè)。

染色體計(jì)數(shù): 取受精10h后的胚胎, 0.1%秋水仙素溶液處理2h, 0.075 mol/L氯化鉀低滲處理30min, 重復(fù)2次。然后使用新配置的卡諾固定液固定3次, -20℃保存。熱滴片后顯微鏡下觀察拍照, 進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用OriginPro 9.1作圖, 利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析, 差異顯著度為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期的倍性檢測(cè)

受精10h時(shí), 對(duì)照組中, 只有20條染色體的長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”的二倍體細(xì)胞。在誘導(dǎo)處理組中, 可以觀察到二倍體(2n=20)、三倍體(3n=30)及四倍體(4n=40)的細(xì)胞(圖1), 而且同一個(gè)誘導(dǎo)處理組中有三者同時(shí)存在的情況, 同時(shí)也存在一些非整倍體細(xì)胞。染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明誘導(dǎo)處理中存在長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體胚胎。

受精24h時(shí), 對(duì)D形幼蟲群體進(jìn)行倍性檢測(cè), 與對(duì)照組只有二倍體幼蟲相比, 誘導(dǎo)處理組幼蟲群體通常由2—3個(gè)不同倍性的幼蟲群體組成(圖2), 而且幼蟲群體中不同倍性幼蟲所占比例會(huì)隨誘導(dǎo)條件的變化而改變。

受精180d時(shí), 對(duì)表1中自上而下3個(gè)處理組的幼貝進(jìn)行倍性檢測(cè), 其檢測(cè)數(shù)量分別為73、45和66個(gè)。幼貝倍性檢測(cè)結(jié)果顯示, 2個(gè)誘導(dǎo)處理組中檢測(cè)到長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體幼貝(圖2), 并且與受精24h相比, 四倍體率有顯著的降低(表1)。

2.2 CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”D形幼蟲四倍體率的影響

圖1 長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”二倍體(a)、三倍體(b)、四倍體(c)和非整倍體(d)胚胎中期分裂相Fig.1 Example metaphase of diploid (a), triploid (b), tetraploid (c) and aneuploidy (d) embryos of C.gigas “Haida No.2”

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”D形幼蟲及幼貝倍性Fig.2 Ploidy composition of C.gigas “Haida No.2” larvae and spat samples determined by flow cytometry

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”180日齡幼貝倍性Tab.1 Flow cytometry analysis of C.gigas “Haida No.2” spats at 180 day

在不同誘導(dǎo)條件下, 長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率范圍為4.30%—37.82%(圖3)。受精24h時(shí), CB濃度對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率有顯著的影響(P＜0.05), 在CB濃度為0.7 mg/L時(shí)四倍體率顯著低于其他CB濃度, 四倍體率和CB濃度沒有表現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系。起始誘導(dǎo)時(shí)間能顯著影響長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率(P＜0.05), 起始誘導(dǎo)時(shí)間為15min時(shí), 可以顯著提高四倍體率。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的范圍內(nèi), 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間沒有對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間三者的交互作用對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率有顯著影響(P＜0.05)。長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”在CB濃度為0.5 mg/L、起始誘導(dǎo)時(shí)間為15min及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間為20min時(shí), 長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率出現(xiàn)最大值, 為37.82%。

2.3 CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體的D形幼蟲率的影響

在不同誘導(dǎo)條件下, D形幼蟲率為0.73%—47.22%(圖4)。受精24h時(shí), CB濃度對(duì)D形幼蟲率有顯著的影響(P＜0.05), CB濃度為0.3 mg/L時(shí), D形幼蟲率顯著高于其他CB濃度, 隨CB濃度增加, D形幼蟲率呈逐漸下降的趨勢(shì), 且在CB濃度為0.9 mg/L時(shí),D形幼蟲率最低。誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間顯著影響D形幼蟲率(P＜0.05), 且誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間與D形幼蟲率存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系, D形幼蟲率隨誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間的增加而降低。起始誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)D 形幼蟲率影響顯著(P＜0.05), 起始誘導(dǎo)時(shí)間為5min時(shí), D形幼蟲率顯著高于起始誘導(dǎo)時(shí)間為10min和15min。但是三者的交互作用對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率影響不顯著(P＞0.05)。

3 討論

圖3 不同CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率的影響Fig.3 Effects of different CB concentrations, initial induction times and induction durations on tetraploid rate of C.gigas “Haida 2”

圖4 不同CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體D形幼蟲率的影響Fig.4 Effects of different CB concentrations, initial induction times and induction durations on D larvae rate of C.gigas “Haida No.2”

除了一些可控的因素外, 卵子發(fā)育同步性對(duì)四倍體率的影響不容忽視[13]。本研究為了降低卵子同步性對(duì)四倍體誘導(dǎo)結(jié)果的影響, 實(shí)驗(yàn)親貝采用同一批人工繁育且同步促熟的長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”二倍體, 以盡可能保證親貝性腺發(fā)育成熟程度的同步性。受精24h幼蟲群體的倍性檢測(cè)結(jié)果表明, 直接誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”二倍體的受精卵可以獲得其四倍體幼蟲, 而且CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率有顯著影響。對(duì)CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化, 在一定程度上可以提高幼蟲四倍體率。CB濃度對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率和D形幼蟲率均有顯著影響, 隨著CB濃度增加, D形幼蟲率逐漸降低, 說明隨著CB濃度的增加, 其誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng), 但是四倍體率并沒有隨之增加, 而是CB濃度為0.7 mg/L時(shí)的四倍體率低于CB濃度為0.5 mg/L的四倍體率。其原因可能是隨著CB濃度增加, CB毒性作用增強(qiáng), 導(dǎo)致幼蟲的死亡率上升, 而存活幼蟲中四倍體幼蟲的相對(duì)比例并沒有提高, 而且倍性檢測(cè)對(duì)象是存活幼蟲群體, 最終導(dǎo)致CB濃度增加而四倍體率沒有相應(yīng)增加的現(xiàn)象。這說明并不是CB濃度越高, 誘導(dǎo)效果越好。起始誘導(dǎo)時(shí)間可以顯著影響長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率和D形幼蟲率, 四倍體率在起始誘導(dǎo)時(shí)間為15min高于其他起始誘導(dǎo)時(shí)間, 說明同一批受精卵有一個(gè)相對(duì)集中釋放第一極體的時(shí)期, 在該時(shí)期對(duì)受精卵進(jìn)行誘導(dǎo)處理, 可以高效的抑制受精卵第一極體釋放, 從而獲得較高的四倍體率。起始誘導(dǎo)時(shí)間為15min時(shí)的D形幼蟲率顯著低于起始誘導(dǎo)時(shí)間為5min的D形幼蟲率, 表明CB對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的受精卵的作用程度不同,CB對(duì)受精15min后的受精卵的作用效果較為顯著。同時(shí), 在起始誘導(dǎo)時(shí)間為15min時(shí), 四倍體率較高而D形幼蟲率較低, 說明有效抑制受精卵第一極體釋放會(huì)導(dǎo)致D形幼蟲率的降低。誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率沒有顯著影響, 而對(duì)D形幼蟲率有顯著影響, 一方面說明誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)四倍體率和D形幼蟲率的影響有明顯的差異, 另一方面也說明不能通過降低D形幼蟲率來提高四倍體率。另外, 誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體率沒有顯著影響, 也可能是誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間梯度小導(dǎo)致的[15]。

染色體計(jì)數(shù)結(jié)果顯示在同一個(gè)處理中存在不同倍性的長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”胚胎細(xì)胞, 這在很大程度上是由卵子發(fā)育不同步導(dǎo)致的。在單個(gè)牡蠣卵子數(shù)量可以滿足實(shí)驗(yàn)需求的情況下, 可以采用對(duì)單個(gè)牡蠣的卵子進(jìn)行誘導(dǎo), 避免不同牡蠣之間卵子發(fā)育不同步對(duì)誘導(dǎo)的影響, 提高目標(biāo)倍性的誘導(dǎo)效果[12]。染色體計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)的一些非整倍體, 可能是染色體的不同分離方式導(dǎo)致的[16]。幼貝檢測(cè)結(jié)果表明, 由長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”二倍體的受精卵直接誘導(dǎo)其四倍體是可行的, 但是存在四倍體率低的問題。造成這種情況的原因, 一方面可能是CB誘導(dǎo)導(dǎo)致幼蟲染色體異常增加, 很多無(wú)法適應(yīng)染色體異常增加的四倍體幼蟲在生長(zhǎng)過程中逐漸死亡; 另一方面, 與正常二倍體相比, 四倍體幼蟲生長(zhǎng)速度較慢[9], 當(dāng)誘導(dǎo)處理組的大多數(shù)幼蟲變態(tài)附著后, 仍有大部分四倍體幼蟲未能變態(tài)附著, 并且由于后期附著環(huán)境變差,導(dǎo)致一定比例的四倍體幼蟲不能完成變態(tài)附著。在已有的關(guān)于貝類四倍體的誘導(dǎo)研究中, 不僅出現(xiàn)幼蟲培養(yǎng)過程中四倍體幼蟲比例逐漸下降的問題[10], 而且變態(tài)附著后的養(yǎng)成過程中也存在幼貝四倍體率降低的現(xiàn)象[17]。即使采用物理方法誘導(dǎo)牡蠣四倍體, 也同樣出現(xiàn)高死亡率[18]。由貝類二倍體直接誘導(dǎo)其四倍體, 高死亡率是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象。

綜上所述, 本研究分析了CB濃度、起始誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體的影響, 篩選出較為適宜的長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體的誘導(dǎo)條件為CB濃度0.5 mg/L, 起始誘導(dǎo)時(shí)間15min和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間20min, 而且在該條件下獲得了長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體幼貝。研究結(jié)果為培育長(zhǎng)牡蠣“海大2號(hào)”四倍體提供了重要的基礎(chǔ)資料。