綿羊Myostatin前肽對成肌細胞的分化作用

杜 瑋，夏 俊，劉明軍，張 楊

(新疆畜牧科學院畜牧研究所，烏魯木齊 830000)

0 引 言

【研究意義】一種從小鼠骨骼肌cDNA文庫中克隆的新的轉化生長因子—Myostatin，具有抑制骨骼肌生長的功能[1、2]。1997年Grobet，Kambadur發現皮爾蒙特牛和比利時蘭牛這2個牛具有雙肌性狀，大腿、臀部、胸部、上臂等肌肉異常發達，肌肉質量較普通牛高出了20%～25%，經過研究發現引起這種表型的原因是Myostatin基因的自然突變現象；2006年Alex Clop研究發現Texel雙肌綿羊和普通綿羊相比，具有明顯雙肌現象，肌肉肥大、肌肉生長速度快、體型龐大、肉骨比高、瘦肉率高、產羔率高等特性，分析其原因Myostatin基因編碼區沒有差異， 3’端非翻譯區(3’UTR)發生作用位點G→A的突變，這個突變產生了microRNA1和microRNA206兩種microRNA，進而抑制了Myostatin基因的翻譯，Myostatin 基因的功能被破壞，這種突變導致特克塞爾羊(Texel sheep)出現了雙肌性狀；從一個兒童的Myostatin基因中檢測到一個鳥嘌呤突變成腺嘌呤。這個突變處于外顯子1的下游，導致了第108位堿基對的錯誤剪接，Myostatin基因突變同樣可以引起人類嬰兒的肌肉發達[3-5]。Myostatin作為一種重要的負調控因子，發現在生物育種及醫學等學科的發展起著舉足輕重的作用，已經成為分子生物學界的重要研究課題。【前人研究進展】研究表明增加Myostain前肽的量，可以抑制或影響Myostatin的生物學活性。Yang(2001)研究發現將Myostain前肽蛋白過表達的轉基因小鼠體重增加了20%～110%，其他性狀不受干擾，小鼠可以正常繁殖。將突變前肽注射到小鼠體內，小鼠肌肉量增加了25%～30%[6]。Neil等(2003)研究發現,鼠Myostain 前肽的第76位天冬氨酸(Asp)是金屬蛋白酶家族BMP-1/TLD 的特異性切割位點，金屬蛋白酶切割Myostain 前體后，能釋放出C端二聚體，C 端二聚體與相應的受體結合進而激活下游信號通路；將天冬氨酸突變為丙氨酸(Ala)以后，突變的前肽依然能夠與C 端二聚體以潛在復合物的形式結合，但卻不能被BMP-1/TLD 蛋白酶水解[7]。【本研究切入點】慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在 HIV-1病毒(人類免疫缺陷I型病毒)基礎上改造而成的病毒載體系統，安全性很高，能夠將外源基因插入細胞基因組內，實現目的基因的穩定表達，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。【擬解決的關鍵問題】通過基因工程手段將Myostatin前肽進行基因修飾，把Myostatin前肽的第76位天冬氨酸突變為丙氨酸(D76A)，構建基因優化后的Myostatin前肽過表達慢病毒質粒，包裝慢病毒，并檢測Myostatin前肽對C2C12細胞的分化能力，研究Myostatin前肽蛋白的表達對動物肌肉生長發育的影響及其調控機制提供試驗依據，為以抑制Myostatin基因功能為目的的生物制劑的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

胎牛血清Thermo；DMEM Thermo；Age I和NotI購自New England Biolabs公司；LATaqDNA聚合酶購自TaKaRa生物公司；IPTG、X-gal和DNA marker購自北京全式金公司；大腸桿菌菌株DH5α、PBS、PCR產物回收純化、質粒小提、大量抽提試劑盒、細胞RNA提取試劑盒均購自上海生工；細胞轉染試劑Lipofectamine 2000 、一抗(Anti-β-actin rabbit polyclonal antibody，Anti-Flag rabbit polyclonal antibody)，二抗(HRP-conjugated Goat Anti-rabbit IgG)、 載體及三質粒系統：pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro，pSPAX2、pMD2G、MSTN-part質粒均購自Invitrogen公司。小鼠成纖維細胞株C2C12、293T由該實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 Myostatin前肽過表達慢病毒重組質粒的構建及制備

根據GenBank中綿羊MSTN全長mRNA序列(NM_001009428)，使用Oligo 6.0軟件設計引物，擴增大小為750 bp的Myostatin前肽基因Lv-MSTN-F:ctagaggatctatttccggtgaattcgccaccATGAATGAGAACAGCGAGC

LV-MSTN-R:cttctagaactagtctcgaggaattCTCTCCTAGATCTTTTTGGTGTGTCTG

PCR擴增采用如下體系：KOD plus DNA polymerase 1 μL，10×Buffer 5 μL，MgSO4(25 mmol/L) 2 μL，dNTPs(2 mmol/L) 5 μL，引物各1 μL (10 μmol/L)，補水至50 μL。PCR反應程序： 95℃ 5 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 60 s，35個循環；72℃延伸10 min。經瓊脂糖凝膠電泳，DNA測序比對證實序列正確后，將其插入pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro載體中，后用T4DNA連接酶連接。將連接反應產物轉化TOP10感受態細菌，調取單克隆菌落，PCR擴增篩選，對鑒定的陽性質粒送上海生工公司進行測序。驗證正確的重組質粒命名為LV-CMV-MSTN-flag-GFP。

1.2.2 Myostatin前肽過表達慢病毒的包裝

病毒包裝前進行293T細胞培養，第1 d取對數生長期293T細胞，接種于直徑為15 cm的細胞培養皿，第2 d待細胞密度達70%～80%時用Lipofectamine 2000轉染，進行病毒包裝。分別用250 μL Opti-MEM培養基稀釋4 μg質粒和8 μL脂質體Lipofectamine 2000，兩者混合后室溫靜置20 min，加入培養皿中，6 h后換液，37℃培養箱培養48 h，采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達后收集上清液。按照要求分裝病毒，標記，-80℃冰箱保存[8]。

1.2.3 滴度檢測

第1 d將293T細胞消化后稀釋至1×105/mL, 加入96孔板，100 μL/孔，為每個病毒準備6個孔。放入37℃，5% CO2培養箱中培養。 第2 d，準備6個1.5 mL離心管，第1個離心管中加入病毒液10 μL，做3倍梯度稀釋，共6個稀釋度。第3 d，有需要加puro篩選的孔，先吸去100 mL含病毒培養基，加入100 μL含1.5 μg/mL puro的10%FBS完全培養基。最后觀察結果并計算滴度，在觀察結果前6 h更換新鮮10%FBS完全培養基，從孔中吸出80 μL培養基，再加入80 μL新鮮10%FBS完全培養基，置37℃，5%CO2培養箱中培養。6 h后熒光顯微鏡下觀察結果，以熒光百分比為10%～30%的孔計算病毒滴度。

滴度(TU/mL )=細胞數×熒光百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數×103。

1.2.4 C2C12細胞培養及轉染

取正常培養的C2C12細胞，長滿后分板，按照每個6孔板一個孔50萬細胞鋪板，12 h后進行感染。取2支1.5 mL的EP管，每管加入800 μL的完全培養基，并且分別加入200 μL的LV-CMV-MSTN-flag-GFP、LV-CMV-GFP病毒，MOI=20，再分別加入終濃度為5 μg/mL的polybrene，混勻后靜置5 min。另取第3支1.5 mL EP管，加入1 mL完全培養基。將準備好的細胞去除培養液，將混勻后的病毒液體分別加入不同的孔。37℃，5%CO2，培養48 h后顯微鏡觀察，并加入嘌呤霉素進行穩定株篩選。篩選后細胞收樣，提取蛋白進行WB檢測。

1.2.5 成肌細胞分化誘導及其指標測定

按4×105/孔的細胞量接種至6孔板中培養，24 h后匯合度達到80%，換用含體積分數2%馬血清的DMEM誘導培養基培養72 h，進行固定及封閉，加入肌球蛋白重鏈單克隆抗體(anti-MyHC)(稀釋比為1∶400)，4℃過夜，TBS沖洗后加入山羊抗鼠熒光二抗(FITC-IgG)(1∶200)及100 ng/mL細胞核染色劑 DAPI，室溫作用1 h，TBS沖洗，Nikon熒光顯微鏡成像。

使用NIS-Elements(Nikon)軟件測量視野內肌管中細胞核的數目，用MyHC陽性的細胞個數除以整個視野中細胞核數目，所得的百分數即為肌管融合率；使用軟件測量視野中每條肌管直徑大小，統計直徑最大的20個數據，取其平均值作為該視野的肌管直徑值。每孔隨機選取10個視野的細胞，取其均值使用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達

選用穩定表達目的基因的細胞株接種于6孔板中，待長滿后即可進行實驗。吸出培養基，用0.01 mol PBS沖洗3遍后加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白進行十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺膠體電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳，將蛋白用電轉法轉印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用含5%脫脂奶粉封閉液(TBST)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉1 h。用一抗稀釋液稀釋相應的一抗(Anti-β-actin rabbit polyclonal antibody，Anti-Flag rabbit polyclonal antibody)，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次，10 min/次。用TBST稀釋HRP標記的羊抗兔二抗(HRP-conjugated Goat Anti-rabbit IgG)1∶5 000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育1 h。TBST充分洗滌PVDF膜5次，10 min/次。將ECL試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，發光顯影。

2 結果與分析

2.1 Myostatin前肽克隆

研究表明，獲得750 bp左右的片段，與理論大小相符，理論上Myostatin前肽為244aa即732 bp，732 bp加上下游酶切位點及保護性堿基18 bp，因此，片段長度為750 bp。圖1

注：M:10 000 bp marke，1、2：Myostatin前肽

2.2 Myostatin前肽過表達慢病毒載體的構建和鑒定

用T4 DNA連接酶將Myostatin前肽的PCR產物連接到慢病毒載體pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro，構建重組質粒，經EcoR1酶切后可見有約10 000 bp的線性條帶；慢病毒載體大小為8 974 bp，目的基因即Myostatin前肽為750 bp，構建了重組質粒。圖2

注：M:10 000 bp marker；1、慢病毒載體膠回收結果；慢病圖載體圖譜

研究表明，PCR擴增所得產物約1 000 bp(羊Myostatin前肽序列片斷長度為750 bp+載體部分序列300 bp)，將陽性克隆送測序，與預期結果完全一致，構建了Myostatin前肽的慢病毒重組質粒，將其命名為LV-CMV-MSTN-flag-GFP。圖3

注：1-7：MSTN-part單克隆鑒定PCR產物；M：10 000 bp DNA Marker

2.3 Wb檢測

研究表明，LV-CMV-MSTN-flag-GFP感染C2C12細胞后， Myostatin前肽的表達水平顯著上調，在Western blot反應的抗原固定后，用一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗反應顯色后，肉眼觀察顯色反應后的顏色深淺，即作為一種定性的判斷，LV-CMV-MSTN-flag-GFP在靶細胞中能夠有效上調目的基因Myostatin前肽的表達。圖4

注：C2C12-Blank：空白對照組；C2C12-NC：LV-CMV-GFP感染組；C2C12-MSTN：LV-CMV-MSTN-flag-GFP感染組

2.4 滴度

通常滴度單位為TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數。IU/mL，指每毫升中含有的整合活性的病毒顆粒數。“IU”為integration units的縮寫，中文為整合單位，測定病毒滴度的方法是在熒光顯微鏡下觀察，計算病毒滴度(病毒滴度=發綠色熒光的細胞數×病毒稀釋倍數)。

對照組滴度=4×104×10%×MOI(1)×病毒稀釋倍數(30)×103=1×108TU/mL(選取0.033 μL病毒孔)

試驗組滴度=4×104×10%×MOI(1)×病毒稀釋倍數(30)×103=1×108TU/mL(取0.033 μL病毒孔)圖5

圖5 滴度測定Fig.5 Viral titers identification

2.5 過表達Myostatin前肽對成肌細胞的分化

2.5.1 免疫熒光檢測結果

分別用過表達Myostatin前肽的慢病毒重組質粒(LV-CMV-MSTN-flag-GFP)和空載體(LV-CMV-GFP)慢病毒感染C2C12細胞，72 h后觀察LV-CMV-MSTN-flag-GFP和LV-CMV -GFP感染效率。研究表明，實驗組明顯的長條狀肌管，Myostatin前肽基因的過表達顯著抑制了Myostatin基因的表達，從而影響肌管的形成，抑制了分化的進程。圖6

注：B：未處理的C2C12細胞；NC：感染LV-CMV-GFP的C2C12陰性對照細胞株；MSTN：感染LV-CMV-MSTN-flag-GFP的C2C12實驗組

2.5.2 肌管融合率的測定

試驗共計測定了3個重復。研究表明，作為分化指標的肌管融合率，未處理組、對照組、試驗組肌管融合率分別為5.38%、5.62%、9.38%，試驗組即轉染Myostatin前肽的肌管融合率顯著高于對照組和未處理組(P<0.05)。表明Myostatin前肽過表達細胞在分化程度上顯著高于非轉化成肌細胞，Myostatin前肽基因的過表達顯著促進了成肌細胞的分化。分析原因是過量的Myostatin前肽轉染成肌細胞后，可以與Myostatin成熟肽結合，抑制了Myostatin的功能，促進了肌管的形成。圖7

注：B: 未處理的C2C12細胞；NC：感染LV-CMV-GFP的C2C12陰性對照細胞株；MSTN感染LV-CMV-MSTN-flag-GFP的C2C12實驗組;不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: B:parent cell control; NC: 感染LV-CMV-GFP的C2C12陰性對照細胞株；MSTN：感染Untreated C2C12 cells; NC: C2C12 negative control cell lines infected with LV-CMV-GFP; MSTN: C2C12 treatment group infected with LV-CMV-MSTN-flag-GFP, Different small letter is considered as significant (P<0.05)

圖7 成肌細胞系肌管融合率
Fig.7 Statistical analysis of fusion index.

3 討 論

Myostatin主要由骨骼肌產生，以劑量依賴性發揮作用，是一種分泌蛋白，并且以濃度依賴性的方式限制肌纖維生長。Myostatin分為前肽和成熟肽兩部分，Myostatin前肽位于Myostatin基因的N末端，Myostatin成熟肽位于Myostatin基因的C端是真正具有生物學活性的部分。Myostatin最初在血液中是以沒有生物活性的前體蛋白形式循環的，當機體需要時，該前體蛋白運輸到內質網膜后首先被切除信號肽，然后在裂解位點(RSRR)被金屬蛋白酶切割，去掉前肽(N端)，剩余的成熟肽通過半胱氨酸之間的二硫鍵形成同源二聚體，該二聚體可以與N端前肽構成潛在復合體。Wolfman et al.2003研究表明，潛在復合體中前肽部分的第76位氨基酸即天冬氨酸(Asp)是金屬蛋白酶家族 BMP-1/TLD 的特異性切割位點，當該位點被此類酶水解后就可以釋放出具有生物學活性的C端二聚體[9]。當將Myostatin前肽第76位天冬氨酸突變為丙氨酸后，金屬蛋白酶家族 BMP-1/TLD就無法對其進行切割，無法釋放出C-端二聚，人為增加突變型Myostatin前肽的量，Myostatin前肽會與Myostatin成熟肽結合，從而起到抑制Myostatin生物活性的作用。

Lee et al.2001; Yang et al.2001研究表明，過表達Myostatin前肽可以顯著的降低體外培養的細胞以及轉基因小鼠體內Myostatin基因的生物活性。過表達Myostatin前肽可顯著的增加轉基因小鼠的肌肉質量[5、6]。

Neil等(2003)研究發現鼠Myostatin前肽的第76 位天冬氨酸(Asp)是金屬蛋白酶家族BMP-1/TLD 的特異性切割位點，當該位點被金屬蛋白酶水解后，釋放出具有生物活性的C端二聚體，C 端二聚體與相應的受體結合進而激活下游信號通路[7]；Wolfman et al.2003; ZiCong Li et al.2009研究表明，將天冬氨酸突變為丙氨酸(Ala)以后，突變的前肽依然能夠與C 端二聚體以潛在復合物的形式結合，但卻不能被金屬蛋白酶水解[9、10]；因此，將突變前肽注射到小鼠體內，注射的前肽通過與Myostatin成熟肽結合，抑制Myostatin的生物學功能，進而增加小鼠肌肉量。S.R et al.2006研究表明，在小鼠5周時對其注射2倍劑量的突變型Myostatin前肽可以顯著的增加小鼠肌肉質量，肌肉發達表型的增長主要是來自肌肉肥大而不是增生，同時證明突變型的Myostatin前肽是增加肌肉質量的一種有效的方法[11]。

慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在 HIV-1病毒(人類免疫缺陷I型病毒)基礎上改造而成的病毒載體系統，區別一般的逆轉錄病毒載體，它的優點在于能夠感染多種難感染的細胞，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，且慢病毒能夠將外源基因插入細胞基因組內，實現目的基因的穩定表達。于此同時，慢病毒安全性很高，不產生任何有效的細胞免疫應答。

試驗通過對Myostatin前肽進行基因修飾，把Myostatin前肽的第76位天冬氨酸突變為丙氨酸(D76A)，Myostatin前肽的第76位天冬氨酸(Asp)是蛋白酶家族BMP-1/TLD特異性切割位點，Myostatin前體被該蛋白酶處理后，能釋放本來與前肽非共價結合的C端二聚體活性分子，使其能夠與相應受體結合，激活下游信號傳導通路。當Myostatin的前肽第76位天冬氨酸突變為丙氨酸(D76A)后，能更有效地抑制C端二聚體的活性。于此同時，考慮到將Myostatin前肽突變載體轉染到小鼠成肌細胞(C2C12)轉染效率不高的問題，使用了慢病毒載體，成功構建了Myostatin前肽過表達慢病毒載體，在C2C12細胞上轉染，并進行免疫熒光及Western blot檢測。結果表明，在熒光視野下，感染過表達Myostatin前肽的慢病毒重組質粒(LV-CMV-MSTN-flag-GFP)的試驗組中可見明顯的肌管，表明Myostatin前肽基因的過表達顯著抑制了Myostatin基因的表達，從而促進了肌管的形成。Western blot檢測結果顯示，LV-CMV-MSTN-flag-GFP在靶細胞中能夠有效上調目的基因Myostatin前肽的表達。通過試驗結果說明，構建的Myostatin前肽過表達慢病毒載體對成肌細胞分化作用是有效的，通過Western blot和C2C12細胞分化試驗初步鑒定其體外生物學活性，為體內生物學功能試驗和制備綿羊Myostatin前肽生物制劑打下基礎。

4 結 論

構建過表達Myostatin前肽的慢病毒重組質粒(LV-CMV-MSTN-flag-GFP)，將LV-CMV-MSTN-flag-GFP包裝成慢病毒。感染C2C12細胞后，進一步證實了過表達Myostatin前肽存在抑制Myostatin生物學功能的特性，促進了成肌細胞的分化。