miR-224-5p 通過靶向SMAD5對彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖和凋亡的調控作用*

張姍 鄧銳 李業成 鄧艷 賴思含 何光翠 易海 劉芳 蘇毅

(西部戰區總醫院血液科，四川 成都 610000)

彌漫性大B細胞淋巴瘤是一種非霍奇金淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤的25%～35%，占B細胞腫瘤的37%[1]。彌漫性大B細胞淋巴瘤是淋巴系統的高度侵襲性彌漫性惡性增生性疾病，目前使用利妥昔單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松龍等進行臨床治療，但治療方案對約40%的患者無效[2]。彌漫性大B細胞淋巴瘤5年復發患病率高達40%[3]，同時治療期間的耐藥性也極大地困擾著臨床醫師和患者，約30%的彌漫性大B細胞淋巴瘤患者死于復發或耐藥[4]。因此，迫切需要了解彌漫性大B細胞淋巴瘤發病機制，為彌漫性大B細胞淋巴瘤尋找新的治療方案。近年來，已經初步發現了彌漫性大B細胞淋巴瘤的一些分子發病機制。除了編碼基因，一些非編碼基因，特別是微小RNA(microRNA，miRs)，被認為是調節彌漫性大B細胞淋巴瘤發育的最重要靶標之一[5]。miR-224在彌漫性大B細胞淋巴瘤中低表達，且 miR-224的表達與彌漫性大B細胞淋巴瘤的發病機制相關，是與彌漫性大B細胞淋巴瘤患者預后相關的獨立因素[6]。但miR-224-5p對彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖和凋亡的作用及機制尚不清楚。本文主要探討miR-224-5p對彌漫大B細胞淋巴瘤細胞增殖和凋亡的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RPMI-1640培養基(上海慧穎生物科技有限公司，貨號：C22400500BT)，胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司，貨號：16000-044、15140122)，Lipofectamine 2000轉染試劑(上海恪敏生物科技有限公司，貨號：11668-027)，miR-NC、miR-224-5p mimic、miR-224-5p inhibitor、pc-SMAD5質粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，SYBR-Green PCR試劑盒(賽默飛世爾科技公司，貨號：4309155)，cDNA逆轉錄試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司，貨號：GK8030-20)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京原平皓生物技術有限公司，貨號：GN201-01)，MTT試劑盒(上海信裕生物工程有限公司，貨號：111105-500)，BCA試劑盒(上海易色醫療科技有限公司，貨號：BC201)，cleaved caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體(購自碧云天生物科技有限公司，貨號：AC030-1、AB026、AB112、AF0003)，辣根過氧化物酶標記的二抗、SMAD5抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，貨號： ab6728，ab32529)。

1.1.2 儀器 流式細胞儀購自美國BD公司，MuLTI-SKAN GO 型全自動酶標儀購自美國Thermo 公司，FluorChem HD2凝膠成像系統購自美國Proteinsimple公司， Seahorse XFp 細胞代謝分析儀購自上海諾能生物科技有限公司。

1.1.3 組織樣品 我院收集了腫瘤組織和與腫瘤相鄰的正常組織。該研究得到我院研究倫理委員會的批準，并根據《赫爾辛基宣言》的道德準則進行。所有志愿者及監護人均簽署了有關臨床數據的書面知情同意書。

1.1.4 細胞及培養 人正常B細胞永生化細胞系(HMy2.CIR) 和彌漫大B細胞淋巴瘤細胞系(OCI-LY19、 SU-DHL-4、OCI-LY10、 U2932)購自美國典型培養物保藏中心。細胞于含體積分數為10% 胎牛血清、100 U· mL-1的青霉素和100 μg·mL-1的鏈霉素的RPMI-1640培養基中，在37 ℃，體積分數為5% CO2條件下培養。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組 取對數期細胞，接種于6孔板(1×106·孔-1)。當達到80% 融合，根據Lipofectamine 2000說明書將100 nmoL· L-1的miR-NC、miR-224-5p mimic、miR-224-5p inhibitor、pc- SMAD5質粒分別或聯合轉染進入U2932細胞分別記為miR-NC組、miR-224-5p mimic組、miR-224-5p inhibitor組。未轉染培養的U2932細胞作為Control組。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-224-5p與SMAD5 mRNA表達水平 將所有組織樣品剪碎并研磨，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。將各細胞分別接種在6孔板中，當細胞達到近90% 融合時，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行。反應條件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min 、95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min的40個循環，用U6標準化。miR-224-5p的上游引物序列：5′-GTCGTACCAGTGCAGGGTCCGA-3′，miR-224-5p的下游引物序列：5′-CGCAAGTCCTAGTGGTTCCG-3′；SMAD5 的上游引物序列：5′-CTTGGATGGACGTCTGCAAG-3′；SMAD5 的下游引物序列：5′-CATGGTGAAAGTTGCAGTTC-3′；U6的上游引物序列：5′-GTGGTCCGCGTAGCGAGT-3′，U6的下游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACAT-3′。

1.2.3 MTT法檢測細胞生長 將用轉染的細胞在96孔板中孵育，分別在24、48、72、96 h時用10 μL MTT染料處理細胞，然后與100 μL二甲基亞砜孵育15 min。 用酶免疫分析儀在490 nm處測量吸光值。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖 將細胞接種于6孔板(1×106·孔-1)，直到生長至可見菌落。用甲醇固定菌落，0.25% 結晶紫染色30 min，計數菌落數量。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 培養48 h后，胰酶消化轉染U2932細胞，離心， 按1×106個細胞·mL-1的濃度重懸。細胞懸液中加入5 μL Annexin-V- FITC和5 μL PI，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。細胞凋亡率(%)=早期細胞凋亡率(%)+晚期細胞凋亡率(%)。

1.2.6 蛋白印跡法檢測cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2、SMAD5蛋白相對表達水平 收集各組U2932細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后經 SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗(cleaved caspase-3 1∶1000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1000、SMAD5 1∶1000)在4 ℃ 封閉過夜，接著加入對應山羊抗兔二抗(1:2000)室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光，以GAPDH為內參，使用Quantity One軟件進行分析目標蛋白質的相對表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告檢測靶向關系 收集生長至對數期的U2932細胞接種在12孔板中，并孵育24 h。將1 μg螢火蟲熒光素酶報告基因構建體PGL3-SMAD5-WT(SMAD5野生型)或PGL3-SMAD5-MUT(SMAD5突變型)以及miR-224-5p mimic或miR-NC和PRL-CMV海藻熒光素酶報告質粒轉染細胞，轉染48 h后，細胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統測量熒光素酶的相對活性，用螢火蟲熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對活性。

2 結果

2.1 miR-224-5p在彌漫大B細胞淋巴瘤中低表達 與鄰近的正常組織相比，miR-224-5p在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中明顯下調(P<0.01)，見圖1A；與人正常B細胞永生化細胞系HMy2.CIR相比，彌漫大B細胞淋巴瘤細胞系OCI-LY19、 SU-DHL-4、OCI-LY10、 U2932中miR-224-5p表達明顯下調(P<0.01)，見圖1B。提示可選擇U2932細胞系進行后續實驗。與Control組相比，miR-NC組miR-224-5p表達并無變化，miR-224-5p mimic組miR-224-5p表達明顯上調(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組miR-224表達明顯下調(P< 0.01)，見圖1C。表明轉染成功，可進行后續試驗。

圖1 RT-qPCR檢測miR-224-5p的表達水平

2.2 miR-224-5p過表達抑制彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖 隨著時間的增加，各組細胞吸光值逐漸出現差異：在96 h時，與Control組相比，miR-NC組U2932細胞吸光值無明顯變化，miR-224-5p mimic組U2932細胞吸光值明顯減少(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組U2932細胞吸光值明顯增加(P<0.01)，見圖2A。與Control組相比，miR-NC組U2932細胞克隆細胞數目無明顯變化，miR-224-5p mimic組U2932細胞克隆細胞數目明顯減少(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組U2932細胞克隆細胞數目明顯增加(P<0.01)，見圖2B、C。

2.3 miR-224-5p過表達誘導彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞凋亡 與Control組相比，miR-NC組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2水平無明顯變化，miR-224-5p mimic組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax水平明顯升高、Bcl-2水平明顯降低(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax水平明顯降低、Bcl-2表水平達升高(P<0.01)，見圖3。

圖2 miR-224-5p過表達對彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖的影響

圖3 miR-224-5p 過表達對彌漫大B細胞淋巴瘤U2932凋亡的影響

2.4 miR-224-5p靶向下調SMAD5 通過TargetScan數據庫預測，miR-224-5p與SMAD5 3′UTR區存在結合位點，見圖4A。通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶向關系，miR-224-5p高表達明顯抑制了含有野生型SMAD5質粒的熒光素酶活性(P<0.01)，但對突變型SMAD5質粒的熒光素酶活性無影響，見圖4B。與鄰近的正常組織相比，miR-224-5p在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中SMAD5明顯上調(P<0.01)；在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中miR-224-5p與SMAD5表達負相關，見圖4C、D。與Control組相比，miR-NC組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞SMAD5水平無明顯變化，miR-224-5p mimic組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞SMAD5水平明顯降低(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞SMAD5水平升高(P<0.05)，見圖4E。

圖4 miR-224-5p 靶向下調SMAD5

2.5 miR-224-5p過表達靶向SMAD5抑制彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖并誘導其凋亡 與Control組相比，miR-224-5p mimic 組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞中SMAD5蛋白水平明顯下調(P<0.01)，pc-SMAD5組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞中SMAD5蛋白水平明顯上調(P<0.01)；與miR-224-5p mimic 組相比，miR-224-5p+pc-SMAD5組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞中SMAD5蛋白水平明顯上調(P<0.01)，見圖5A。與Control組相比，miR-224-5p mimic 組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932克隆細胞數目明顯減少、細胞凋亡率明顯增加、cleaved Caspase-3和Bax水平明顯升高、Bcl-2水平明顯降低(P<0.01)，pc-SMAD5組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932克隆細胞數目明顯增加、細胞凋亡率明顯減少、cleaved Caspase-3和Bax水平明顯降低、Bcl-2水平明顯增加(P<0.01)；與miR-224-5p mimic 組相比，miR-224-5p+pc-SMAD5組彌漫大B細胞淋巴瘤U2932克隆細胞數目明顯增加、細胞凋亡率明顯減少、cleaved Caspase-3和Bax水平明顯降低、Bcl-2水平明顯增加(P<0.01)，見圖5B～E。

3 討論

彌漫性大B細胞淋巴瘤高發的可能因素包括病毒感染、基因組易位或遺傳改變、環境因素、化學因素和免疫系統疾病等等，其病因復雜，發病機制尚不清楚[7]。盡管大多數情況可通過基于蒽環類藥物的聯合化療和單克隆抗體利妥昔單抗治愈，但許多患者仍存在對化療不敏感或治療后復發問題[8]。因此，急需深入了解彌漫性大B細胞淋巴瘤發病機理及尋找淋巴瘤發病和發展的重要分子生物學標志。miRNA是一類廣泛存在于真核細胞中19～22個核苷酸構成內源性小非編碼RNA調節因子，可通過負調控其靶mRNA的穩定性或翻譯效率來轉錄后調節基因表達[9]。miRNA在多種生物學過程中起著重要作用，包括發育，細胞增殖，分化和凋亡[10]。miRNA表達表現出組織特異性和時間差異。研究11]表明miR-224-5p在子宮頸癌、結腸癌、非小細胞肺癌癌等腫瘤中上調，影響腫瘤細胞的轉移，侵襲和凋亡。但miR-224-5p在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中低水平表達，抑制腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲，并促進腫瘤細胞的凋亡[12-14]。本研究發現，在彌漫大B細胞淋巴瘤組織和細胞系OCI-LY19、 SU-DHL-4、OCI-LY10、 U2932中miR-224-5p表達下調。同時，miR-224-5p過表達明顯抑制彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖，并誘導彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞凋亡，miR-224-5p低表達明顯誘導彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖，并抑制彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞凋亡。

圖5 miR-224-5p過表達靶向SMAD5對彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖和凋亡的影響

為了更好地了解miR-224-5p對彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖和凋亡的作用機制，我們使用TargetScan數據庫預測miR-224-5p的靶基因，發現miR-224-5p與SMAD5 3’UTR區存在結合位點，并通過雙熒光素酶報告實驗驗證該靶向關系，發現miR-224-5p高表達明顯抑制了含有野生型SMAD5質粒的熒光素酶活性，但對突變型SMAD5質粒的熒光素酶活性無影響，說明miR-224-5p與SMAD5直接靶向結合。SMAD5定位于髓系腫瘤常被刪除的5q31區域，提示可能是抑癌基因，但在分析大量不同的人類原發腫瘤和癌細胞系時，SMAD5基因未發現下調[15]。此外，SMAD5在結直腸癌中的表達增加，預示SMAD5可能為致癌基因[16]。本文研究發現SMAD5在彌漫大B細胞淋巴瘤組織中高表達，且miR-224-5p靶向下調SMAD5的表達，同前人發現SMAD5在彌漫大B細胞淋巴瘤中高表達相一致[17]。SMAD5表達水平和細胞的增殖凋亡密切相關，如miR-23a和miR-27a通過靶向SMAD5促進人顆粒細胞凋亡[18]。本研究發現，共轉染pc-SMAD5逆轉了miR-224-5p對彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖和凋亡的作用，說明miR-224-5p過表達靶向SMAD5抑制彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖并誘導其凋亡。但本實驗僅為體外細胞實驗，動物體內實驗及更為詳細的分子通路機制還有待進一步去研究探討。

4 結論

miR-224-5p過表達靶向SMAD5抑制彌漫大B細胞淋巴瘤U2932細胞增殖并誘導其凋亡，因此miR-224-5p 和SMAD5有望成為彌漫大B細胞淋巴瘤的治療靶點。