PM2.5對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響及機制*

趙培 劉晶 于芳 于悅卿 高偉 路永剛 李永輝 帖彥清

(1.河北省人民醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050051；3.河北省疾病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050051)

近年來石家莊市空氣污染嚴(yán)重，特別是PM2.5顆粒物含量高，心血管疾病多發(fā)，這兩種現(xiàn)象可能有因果關(guān)系，引起了廣泛的社會關(guān)注[1-2]。動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病理學(xué)改變，被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病，循環(huán)中的白細(xì)胞參與該慢性炎癥反應(yīng)。研究認(rèn)為PM2.5能夠避開呼吸系統(tǒng)屏障進(jìn)入血液循環(huán)，擾亂先天免疫機制[3-4]。在PM2.5的刺激下血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起與動脈粥樣硬化相關(guān)的各種炎癥因子、趨化因子及黏附因子的釋放，在這些細(xì)胞因子的作用下，循環(huán)中的單核細(xì)胞遷移到病變血管內(nèi)膜處并向內(nèi)皮下移動分化為巨噬細(xì)胞，吞噬周圍的脂質(zhì)成分等相關(guān)物質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，同時在適宜的微環(huán)境作用下促進(jìn)血管動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展[5]。本研究旨在探討PM2.5能否加速ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展并探討其相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級8周齡體質(zhì)量(20±2)g、ApoE-/-小鼠購自卡文斯實驗動物有限公司(中國常州)[生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2016-0010]，飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院臨床研究中心SPF級動物房(溫度：20～24 ℃，濕度：45%～55%)，每籠5～6只。采用高脂飲食喂養(yǎng)8周(含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%膽固醇)。動物實驗在河北省人民醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(冀)2015-0065]進(jìn)行。該動物實驗經(jīng)過了河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(201922)，實驗嚴(yán)格遵循3R原則給予人道關(guān)懷。PM2.5準(zhǔn)備：采用TH-150D型智能中流量空氣總懸浮顆粒物采樣器24 h連續(xù)中流量采樣進(jìn)行細(xì)顆粒物(PM2.5)的收集。將收集的PM2.5采用液氮冷凍干燥成粉末后于黑暗中4 ℃下儲存。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模處理 將ApoE-/-小鼠隨機分為PM2.5組(n=16)和對照組(n=16)。小鼠PM2.5用量參考石家莊地區(qū)正常成人每天PM2.5吸入量(2017年石家莊平均PM2.5為65 μg/m3)。每天將10 mg的PM2.5粉末懸浮在4.8 mL的生理鹽水中，PM2.5組每只小鼠每天氣管滴注0.3 mL PM2.5混懸液一次，對照組氣管滴注相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 小鼠全血重金屬測定 小鼠眼球取血，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS， Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)測定全血的重金屬含量，同時測定小鼠氣管滴注所用的PM2.5混懸液的重金屬含量。

1.2.3 主動脈根部斑塊面積及成分分析 主動脈根部切成5 μm的石蠟切片進(jìn)行Movat染色，評估斑塊大小。天狼星紅染色后，評價斑塊內(nèi)的膠原含量的變化。抗mac-2、α-肌動蛋白抗體免疫組化染色檢測斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞Mφ(galectin-3/MAC-2)、平滑肌細(xì)胞(β-actin)的變化。

1.2.4 降主動脈斑塊內(nèi)部炎癥因子基因表達(dá)檢測 使用Trizol兩步法抽提降主動脈的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行實時熒光定量PCR。斑塊內(nèi)部相關(guān)因子及內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)引物序列，見表1。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血液中重金屬含量測定 PM 2.5組全血中重金屬含量顯著升高，特別是鋁、釩和鐵(表2)；PM2.5組小鼠的全血重金屬比例與PM2.5混懸液相似(表3)。表明PM2.5重金屬顆粒可以通過氣管滴注法進(jìn)入ApoE-/-小鼠循環(huán)系統(tǒng)。

表2 兩組小鼠血液中重金屬含量比較

表3 PM2.5混懸液重金屬的成分和含量(μg/L)

2.2 PM2.5對斑塊的影響 PM2.5處理后動脈根部斑塊面積顯著增加，斑塊中巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，斑塊中的膠原含量降低(P<0.05)，平滑肌數(shù)量無明顯變化(P>0.05)，見圖1、表4。提示PM2.5促進(jìn)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展。

圖1 PM2.5處理對小鼠斑塊面積以及細(xì)胞成分的影響

表4 兩組主動脈根部斑塊面積及成分比較

2.3 PM2.5對動脈粥樣斑塊中炎癥因子基因表達(dá)的影響 與對照組比較，PM2.5組IL-6、Lp-PLA2、MCP-1及ICAM-1、iNOS和IL-12的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，CD206和Arg-1表達(dá)下降(P<0.05)(表5)。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種以脂質(zhì)堆積和纖維斑塊形成為特征的在動脈管壁發(fā)生的慢性、低水平的炎癥性疾病。白細(xì)胞，主要是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是先天炎癥免疫的主要組成部分，是抵御異物的第一道防線[6]。近年來大氣污染中PM2.5成分可看作是一種觸發(fā)人體炎癥免疫反應(yīng)的一種異物。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，短期暴露于高濃度或長期暴露于低濃度PM2.5是AS進(jìn)展的一個危險因素，在持續(xù)的PM2.5刺激下，這種免疫炎癥反應(yīng)可能變得持續(xù)和慢性，但其作用機制尚未完全闡明。

表5 兩組降主動脈炎癥性因子基因表達(dá)比較

Lp-PLA2是磷脂酶超家族中的亞型之一，也被稱為是血小板活化因子乙酰水解酶，由血管內(nèi)膜中的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌。Lp-PLA2可水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)中的氧化磷脂，生成脂類促炎物質(zhì)，如溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸，這些物質(zhì)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，刺激產(chǎn)生粘附因子和細(xì)胞因子，這些物質(zhì)可通過趨化炎癥細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生自我強化的循環(huán)，生成更多促炎物質(zhì)，加速AS的進(jìn)展[9]。秦召敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2是冠心病發(fā)生的危險因素，而且與冠心病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理后，ApoE-/-小鼠血管動脈硬化斑塊內(nèi)Lp-PLA2表達(dá)增強，這可能與PM2.5刺激ApoE-/-小鼠血管內(nèi)膜中巨噬細(xì)胞活化，分泌產(chǎn)生更多的Lp-PLA2有關(guān)。

細(xì)胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)，又叫做CD54，屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成員，是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個黏附分子。ICAM-1 在靜息的血管內(nèi)皮細(xì)胞上呈低水平表達(dá)，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)活性。作為白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞跨膜的蛋白質(zhì)，ICAM1在穩(wěn)定細(xì)胞間相互作用和促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移起到重要作用。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，ICAM-1與正常血壓糖尿病患者動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)。國內(nèi)外多項研究[12-13]表明，PM2.5能夠直接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是動脈粥樣硬化起始的條件之一，受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠促使細(xì)胞黏附分子(如ICAM-1)的表達(dá)增加，細(xì)胞粘附分子及其受體之間的相互作用將信號傳遞到單核細(xì)胞中，并導(dǎo)致單核細(xì)胞遷移到血管內(nèi)皮下，攝取ox-LDL，變?yōu)榧せ畹木奘杉?xì)胞，并分化為泡沫細(xì)胞，參與動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。

激活的巨噬細(xì)胞能夠分泌IL-6，其能夠通過激活核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)，使炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄增強，可促使斑塊內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等分泌MCP-1[14]，從而促使更多的單核細(xì)胞聚集、浸潤，并遷移至血管內(nèi)皮下吞噬脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞，從而加速AS的進(jìn)展[15]。MCP-1又能活化白細(xì)胞并介導(dǎo)其產(chǎn)生炎性介質(zhì)IL-6，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞更多地分泌趨化因子MCP-1，形成瀑布效應(yīng)，最終導(dǎo)致AS病變的發(fā)生、發(fā)展[16]。王冬蓮等[17]研究發(fā)現(xiàn)血清MCP-1水平與AS嚴(yán)重程度有關(guān)，并反映了病情的嚴(yán)重程度，可以作為初步預(yù)測急性冠脈事件和判斷AS嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。急性感染、慢性炎癥性疾病、肥胖和生理應(yīng)激反應(yīng)均可促進(jìn)IL-6的釋放，動脈粥樣硬化始于內(nèi)皮損傷，炎癥參與動脈粥樣硬化整個過程[18]。Zamani等[18]證實IL-6可以促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和破裂。張濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在99例高血壓患者中，IL-6水平較高的一組患者頸動脈斑塊內(nèi)-中膜厚度及斑塊面積均高于對應(yīng)低水平組患者。

在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮屏障首先被破壞，并進(jìn)一步表達(dá)粘附因子和受體，導(dǎo)致白細(xì)胞(特別是單核細(xì)胞)進(jìn)一步的聚集和活化。循環(huán)白細(xì)胞(特別是單核細(xì)胞)遷移至損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞處不可逆地分化為巨噬細(xì)胞[20]。已知巨噬細(xì)胞有兩種亞型，第一種為經(jīng)典活化性，這類巨噬細(xì)胞能夠合成大量的促炎細(xì)胞因子(iNOS、IL-12)，促炎細(xì)胞因子刺激白細(xì)胞的募集、活化、分化和存活，能夠促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展；第二種是替代活化型的巨噬細(xì)胞(M2)，其分泌的細(xì)胞因子(Arg-1和CD206)具有抗動脈粥樣硬化的作用。為探知PM2.5對巨噬細(xì)胞亞型的影響，我們進(jìn)一步檢測了動脈斑塊內(nèi)iNOS、IL-12、Arg-1和CD206的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)iNOS和IL-12表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，Arg-1和CD206的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，表明在PM2.5的作用下，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞更多地轉(zhuǎn)化為M1型，促進(jìn)了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

4 結(jié)論

PM2.5暴露加速了ApoE-/-小鼠模型動脈粥樣硬化的進(jìn)展，這可能與PM2.5刺激ApoE-/-小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，分泌產(chǎn)生更多的黏附因子、趨化因子和炎癥因子(Lp-PLA2、IL-6、MCP-1、ICAM1)并促進(jìn)血管內(nèi)膜中巨噬細(xì)胞更多地轉(zhuǎn)化為M1型有關(guān)。