抑制線粒體動力相關蛋白1通過PI3K/AKT通路對糖尿病大鼠七氟醚后處理心肌細胞凋亡的影響*

程虎 陳婷婷 亞力·亞森 吳建江

(新疆醫科大學第一附屬醫院麻醉科，新疆 烏魯木齊830054)

七氟醚(sevoflurane，Sev)具有快速誘導麻醉，對肝、腎功能影響小及穩定的血液動力學等特點，在麻醉中廣泛使用；Sev后處理對心肌細胞具有保護作用，其對糖尿病(diabetic mellitus，DM)患者心肌細胞的保護作用顯著減弱[1-2]。線粒體動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)被激活后募集在線粒體表面，并促進線粒體分裂。研究[3]發現，抑制Drp1可以減輕DM小鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。磷脂酰肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)相關通路在I/R中發揮重要作用。研究[4]顯示促進PI3K/AKT通路可以保護DM大鼠的心肌細胞。本文主要分析Drp1通過PI3K/AKT通路對DM大鼠Sev后處理心肌細胞凋亡的影響，并探究其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(12周，220～250 g，上海斯萊克實驗動物中心，中國)。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司，美國)。Drp1 抑制劑 Mdivi-1 (Med Chem Expres公司，美國)。生化試劑盒、酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒和TDT介導的dUTP-生物素缺口末端標記(TUNEL)試劑盒(碧云天公司，中國)。小動物呼吸機(Inspira ASV，哈佛儀器公司，美國)。BL-420F小動物生物功能實驗系統(成都泰盟科技有限公司，中國)。Mayer's蘇木精和0.5%曙紅水溶液(H8070，DH0050，北京Solarbio公司，中國)。RIPA裂解緩沖液(中國，北京，Beyotime)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(武漢博斯特生物技術有限公司，中國)、抗體購自美國Abcam公司、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司，美國)、顯微鏡(Olympus 公司，日本)。

1.2 大鼠分組、建模和干預方法 將60只大鼠隨機分為假手術(Sham)、I/R、I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組6組。其中I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組通過腹腔注射STZ(60 mg·kg-1，pH=4.5)建立糖尿病模型，Sham組僅接受等量檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1)腹腔注射。在STZ注射后第72 h后用生化試劑盒測量血糖，72 h時尾靜脈空腹血糖(FBG)水平高于16.7 mmol·L-1證明DM模型建立成功。I/R、I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組在DM建模后(或注射檸檬酸鹽緩沖液)后進行結扎建立心肌I/R模型[5]：①腹腔注射1%戊巴比妥(3 mL/kg)麻醉大鼠，通過心電圖四肢導聯進行監測。在第三和第四肋間隙做切口并將大鼠插管連接呼吸機(潮氣量：3 mL/kg，呼吸頻率：60～70 次/min)。②打開心包，然后使用6/0線結扎左前降支冠狀動脈，此時心臟表面立即變為白色，并且心電圖ST段抬高。保持結扎15 min，然后取出絲線進行再灌注，縫合胸腔。③手術后肌肉注射80萬單位的青霉素預防感染。Sham組的大鼠在進行相同的操作但不結扎。建模24 h后，I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組在結扎15 min后腹膜內注射Drp1 抑制劑 Mdivi-1共0.1 mL，總劑量為1.2 mg/kg，其余組注射等量的溶劑[6]。I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1組大鼠根據參考文獻[7]在建立在結扎15 min后吸入Sev，Sev濃度為1%。

1.3 觀察指標和檢測方法

1.3.1 HE染色以及檢測心肌梗死面積 大鼠斷頭處死，取出心臟，沿結扎線分為兩半，以保留結扎線和心尖之間的區域。將組織用4%的多聚甲醛固定并用梯度醇脫水，然后包埋在石蠟中，切成厚度為4 μm的組織做成玻片標本。用Mayer’s蘇木精在室溫下染色10 min，然后用0.5%曙紅水溶液室溫下染色3 min。根據HE染色結果，使用Image Pro Plus 6.0軟件計算心肌梗死面積。梗死面積 =(內膜的弧長+外膜的弧長)/(疤痕的內周+疤痕的外周)×100%。

1.3.2 ELISA檢測cTnI和CK-MB水平 通過ELISA檢測心肌指標肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)，大鼠處死后采集血液樣本，離心(2000 rpm，20 min)收集上層血清。然后使用ELISA試劑盒檢測cTnI和CK-MB根據制造商說明書加入抗體，然后通過酶標儀檢測450 nm處的吸光度，然后根據標準曲線計算濃度。

1.3.3 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡 利用1.3.1中固定的大鼠心臟乳頭肌的石蠟切片進行實驗，經過常規脫蠟、抗原修復處理，并用密封液封閉并修復，然后加入50 μL 的TUNEL溶液在37 ℃下孵育1 h，洗滌后加入100 μL的二氨基聯苯胺在37 ℃下孵育30 min，在顯微鏡下觀察樣品。隨機選擇每個組織的四個視野進行計算，并收集平均值。凋亡指數=凋亡核數/(凋亡核數+正常細胞核數)×100%。

1.3.4 Western blot檢測PI3K、AKT蛋白水平 在梗塞區獲得心肌組織樣本，將組織勻漿、研磨獲得總蛋白，蛋白濃度通過BCA試劑盒測量。使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(PAGE)(80～120 V，90 min)分離40μg的總蛋白。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉移。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h，然后將1∶500稀釋的anti-Drp1、anti-PI3K和anti-AKT添加到PVDF膜中，并在4 ℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h。然后加入化學發光試劑進行顯影。 GAPDH用作內部參考。用Image J軟件分析目標條帶的灰度值。

2 結果

2.1 抑制Drp1對DM大鼠I/R心肌梗死的影響 Sham組無心肌梗死，I/R+DM組梗死面積和心肌組織損傷程度顯著大于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組梗死面積和心肌組織損傷程度顯著小于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組梗死面積和心肌組織損傷程度顯著小于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 各組心肌梗死面積比較

圖1 HE染色檢測心肌損傷和梗死面積

2.2 抑制Drp1對DM大鼠I/R心肌損傷標志因子的影響 I/R組cTnI和CK-MB水平顯著高于Sham組(P<0.05)，I/R+DM組cTnI和CK-MB水平顯著高于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組的cTnI和CK-MB水平顯著低于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組的cTnI和CK-MB水平顯著低于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見表2。

2.3 抑制Drp1對DM大鼠I/R心肌細胞凋亡的影響 I/R組凋亡指數顯著高于Sham組(P<0.05)，I/R+DM組凋亡指數顯著高于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組凋亡指數顯著低于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組凋亡指數顯著低于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見表3、圖2。

表2 各組cTnI和CK-MB水平比較

2.4 抑制Drp1對DM大鼠I/R心肌細胞中PI3K/AKT的影響 I/R組PI3K和AKT蛋白水平低于Sham組(P<0.05)，I/R+DM組PI3K和AKT蛋白水平低于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見圖3和表4。

表3 各組凋亡指數比較

圖2 TUNEL染色檢測各組心肌細胞凋亡情況

圖3 TUNEL染色檢測抑制Drp1對DM大鼠I/R心肌細胞中PI3K/AKT的影響

表4 各組PI3K/AKT通路蛋白水平比較

3 討論

心臟在缺血時會損傷心肌細胞，在再灌注階段，心肌細胞會在血流恢復時再次受到損傷，此過程被稱為I/R損傷。揮發性麻醉藥Sev在再灌注開始時給藥能改善缺血后的心臟功能并減少損傷，這被稱為麻醉后處理，Sev可以緩解心肌細胞的I/R損傷[8]。七氟醚等藥物進行麻醉后處理是減輕心肌損傷的有效策略，但其確切機制尚未完全闡明。近年研究[9]發現，Sev對DM患者心肌I/R的保護作用有顯著的影響。

Drp1具有促進線粒體裂變促進活性氧物質表達的作用[10]。在心肌I/R模型中，Drp1易位至線粒體，導致線粒體裂變和功能障礙，并且抑制線粒體裂變可減少I/R后的心肌損傷并改善心臟功能[11]。DM對線粒體動力學有直接影響，高血糖情況下線粒體變短且變小，并由Drp1介導線粒體快速分裂，在DM小鼠的冠狀內皮細胞或心肌細胞中觀察到與激活的Drp1相關的線粒體裂變增加[12]。據此，我們推測Drp1可能是將DM與I/R損傷聯系起來的一種關鍵分子。本研究結果顯示DM會加劇大鼠I/R心肌損傷誘導凋亡，而Sev后處理和Drp1抑制劑Mdivi-1均可緩解I/R心肌損傷并抑制凋亡，并且Sev聯合Mdivi-1可進一步的緩解I/R心肌損傷并抑制凋亡，抑制Drp1可以進一步提高Sev后處理對DM大鼠I/R的保護作用。Zheng等[13]的研究顯示抑制Drp1可以緩解I/R引起的心肌損傷，而Sev也具有一定的抑制Drp1的功能抑制凋亡。體外研究[14]顯示抑制Drp1可以通過促進線粒體形態恢復，促進Sev對缺氧/復氧心肌細胞的保護作用。這提示DM大鼠I/R心肌組織中Drp1的升高可阻礙Sev對心肌保護作用，抑制Drp1可促進Sev對DM大鼠I/R心肌損傷的保護作用。

研究[15]顯示DM可導致PI3K/AKT通路受損，會阻礙后處理對心肌細胞的保護作用。而Drp1可通過調節PI3K/AKT通路改變細胞中葡萄糖代謝過程[16]。本研究結果顯示I/R 組的PI3K和AKT蛋白水平顯著低于Sham組，I/R+DM組的PI3K和AKT蛋白水平顯著低于I/R組，這與上述研究結果一致，提示PI3K/AKT通路受到抑制會加重DM大鼠的心肌I/R損傷。Drp1可以通過抑制AKT相關通路誘導細胞凋亡[17]。也有研究[18]顯示七氟醚可以通過促進AKT通路緩解I/R損傷；Sev可以通過Drp1緩解抑制氧化應激并調節自噬，緩解心臟I/R并保護心肌細胞[19]。I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM組，并且I/R+DM+Sev+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組，提示Sev和抑制Drp1均可以通過促進PI3K/AKT通路抑制心肌細胞凋亡，保護心肌I/R損傷。但是關于Sev、Drp1以及PI3K/AKT通路之間的作用機制仍需要進一步研究。

4 結論

抑制Drp1可以通過促進PI3K/AKT通路抑制DM大鼠心肌I/R模型的心肌細胞凋亡，從而促進Sev對DM大鼠心肌I/R損傷的保護作用。