MALDI-TOF MS技術在糧油與食品微生物快速鑒定領域的應用

展望韓 偉 莊緒會 鄒海杰 孫 博 陳紅娟 苗海江 羅曉宏 謝嫣琪

(國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037)

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time of fight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術,是20世紀后期發展起來的一種新型“軟電離”質譜技術,廣泛用在臨床診斷、環境監測及食品檢測等多領域。MALDI-TOF MS是基質輔助激光解吸離子源和飛行時間質譜的串聯體，它不產生或者產生很少的碎片離子，使不揮發性與熱不穩定性的生物大分子和高分子聚合物的檢測成為可能[1，2]；這主要得益于MALDI的特點，即準分子離子峰很強，幾乎無碎片離子，因此可直接分析蛋白質酶解后產生的多肽混合物[3]。在MALDI-TOF MS的諸多應用中，微生物快速檢測即是基于微生物表面蛋白分子量檢測而實現的[4，5]。

在糧食及油料種子的收獲、儲存、運輸、銷售及其食品加工過程中，微生物是無處不在的，主要包括的微生物類群：細菌類中的真細菌和放線菌，真菌類中的霉菌、酵母菌和病原真菌等[6，7]。有研究以小麥和玉米為研究對象，分析測定糧食儲藏前以及儲藏過程中微生物多樣性，發現在小麥內部單端孢霉(Trichodermamonocytogenes)，灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、節菱孢霉(Arthrosporium)均有檢出，小麥外部分布著單端孢霉屬(Trichothecium)，鐮刀霉屬(Fusarium)，木霉屬(Trichoderma)，頭孢霉屬(Cephalosporium)，交鏈孢霉屬(Alternaria)和曲霉屬(Aspergillus)；同時，短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)等細菌也被培養法檢出[8]。張秀宇等[9]匯總了全國2016—2019年糧食加工品國家食品安全監督抽檢結果，對不合格項目信息進行分類統計分析，發現不合格項次中微生物原因占比32.86%，真菌毒素占比20.31%。因此，糧油及其食品樣品中所涵蓋微生物的復雜且多樣，必然要求準確性高、鑒定速度快、能實現高通量的鑒定技術儲備。

本文綜述了MALDI-TOF MS技術在微生物鑒定原理、鑒定細菌與真菌的應用實踐以及影響因素等方面的最新研究進展，詳細闡述MALDI-TOF MS技術的優越性同時，展望了它在糧油與食品微生物鑒定中的應用潛力。

1 MALDI-TOF MS技術的原理

MALDI-TOF MS技術的基本原理是：MS用來檢測m/z(質荷比)，MALDI是軟電離技術，基質從紫外線激光吸收能量，以最小的碎片從大分子中產生離子，而TOF是質量分析器，m/z比可以由離子的飛行時間來確定，隨后計算出離子質量[2]。

對于微生物鑒定來說，經過樣品準備、質譜分析、數據庫比對等步驟最終得到鑒定結果。α-氰基-4-羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)和2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)常用于MALDI樣品的制備中。m/z為2 000～20 000的多肽或蛋白質常被用于分析。不同微生物核蛋白的序列和長度等都不同且高度保守，因此，純菌株的一系列質譜峰亦有其獨特性[10-12]。故以蛋白質為靶標分子，微生物的質量圖譜與已知質譜圖數據庫中的特征性質譜圖比對，篩選并確定出特異性圖譜，達到對目標微生物的檢測。在商業化軟件中，未知微生物圖譜與數據庫中標準指紋圖譜進行比較，可以鑒定到細菌的屬、種、甚至亞種[13]。鑒定依據主要有幾點：微生物的特異性指紋圖譜之間的差異性；特征性生物分子提供的模式峰，用于屬、種、株系鑒定；高通量微生物鑒定系統可自動化分析特異性指紋圖譜；樣品的指紋圖譜與數據庫中的標準指紋圖譜進行匹配，依照分值對鑒定結果進行分級和歸類[14]。

2 MALDI-TOF MS技術在微生物鑒定中的影響因素

2.1 MALDI-TOF MS技術與其他鑒定技術比較

微生物鑒定通常包含形態水平、生化水平、基因水平和蛋白水平，常用方法如菌形與菌落分析、生理生化試驗、脂肪酸分析、拉曼光譜法、保守基因檢測、基因雜交及MALDI-TOF MS方法等[15-17]。在現行的國家標準中，糧油與食品微生物多以形態學、生理生化反應或/和保守基因為基礎進行鑒定。

龔艷清[18]等對比MALDI-TOF MS與傳統的生化鑒定方法和聚合酶鏈式反應(PCR)方法鑒定不同株李斯特菌的結果，驗證了MALDI-TOF MS方法的準確性和可重復性。李慧等[19]結合形態學觀察、16S rRNA基因分析及MALDI-TOF MS等三種技術分離并鑒定微生物，研究了土豆燒牛肉方便菜肴產品的脹袋問題。Marta等[20]對比了16S rDNA限制性酶切片段多樣性和MALDI-TOF MS方法、對80株乳桿菌完成鑒定，并認為兩種方法都是有效的鑒定工具。Kazuyuk等[21]同樣對比了16S rRNA基因分析與MALDI-TOF MS方法，MALDI-TOF MS鑒定到種和屬的準確率分別為91.7%(429/468)和97.0%(454/468)。以上結果表明，與傳統鑒定方法比較，基于蛋白水平檢測的MALDI-TOF MS方法同樣具有很高的準確率和復現性。

2.2 基于MALDI-TOF MS技術的設備比較

目前，市場上可選擇的、成熟的MALDI-TOF MS鑒定系統不多，不同質譜系統得到的鑒定結果也不盡相同。Li等[22]對比VITEK MS和MALDI biotyper system鑒定，準確率分別為90%和86%。李艷君等[23]對比MALDI-TOF MS、VITEK MS微生物鑒定系統和顯色培養法，鑒定206株酵母菌，準確率分別是：VITEK MS鑒定儀為82.5%，顯色培養法為67.0%，MALDI-TOF MS 為92.7%。王偉[24]使用VITEK MS和 MALDI 7090TMMALDI-TOF/TOF MS對比分析40株標準菌株和18 株阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)野生菌株，兩者特征峰的出峰位置和相對峰強度無明顯差異。

2.3 其他因素

在MALDI-TOF MS鑒定過程中，除設備類型外，微生物的培養基及培養條件、樣品處理方式、試劑及濃度、靶點涂布均勻性、菌種特異峰及峰值數量等因素也是影響鑒定結果的重要原因。

不同培養基(哥倫比亞血瓊脂、沙氏瓊脂和念珠菌顯色瓊脂)和甲酸濃度(60%～90%)對MALDI-TOF MS鑒定白假絲酵母菌(Candidaalbicans)結果有不同程度的影響；在血瓊脂培養基和沙氏瓊脂培養基中的白假絲酵母菌、用90%濃度的甲酸處理的結果無差異[25]。李鳳琴等[26]研究了培養基成分(查氏酵母提取粉瓊脂培養基、麥芽提取粉瓊脂培養基、麥芽汁瓊脂培養基、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基)和培養時間(5、7、10和14 d)對MALDI-TOF MS鑒定真菌的影響及鑒別產毒和非產毒真菌的可能性；發現CYA、PDA、CA及MA分別是紅曲菌(Monascus)、曲霉屬黃綠組與鐮孢菌屬、曲霉屬黑色組、青霉屬(Penicillium)的最適培養基，最佳培養時間為7 d(MALDI-TOF MS分析而言)，并且黃曲霉產毒株和非產毒株的質譜圖不同。對比直接涂布法、甲酸提取法、甲酸-乙腈提取法等方式的鑒定結果，發現甲酸提取法和CHCA基質更適合MALDI-TOF MS鑒定[24]。從以上結果來看，微生物本身的特點及其生存環境、實驗操作的細節與處理決策等，都可能影響到MALDI-TOF MS的鑒定結果；但影響(屬、種、型的鑒定結果)程度大小、結果的一致性與普遍性規律等仍有賴于大量數據的補充和驗證。

3 MALDI-TOF MS技術在微生物鑒定中的應用現狀

3.1 MALDI-TOF MS技術在細菌鑒定方面的應用

Anhalt等[27]提出了利用質譜法分析蛋白，進行細菌鑒定的概念。至今，相關研究內容已涉及細菌鑒定、細菌分型、抗生素抗性分析及代謝產物。MALDI-TOF MS已成功應用于食品微生物、臨床微生物、養殖病原菌等多個應用領域。在糧油微生物方面，目前細菌檢測沒有足夠的重視和要求。MALDI-TOF MS鑒定在其他領域的應用，對于未來糧油微生物檢測，將有很好的借鑒意義。

3.1.1 食品微生物鑒定

范鐵男等[28]以19株已知標準菌株建庫，鑒定分離自人體糞便、泡菜、乳制品等樣品中60株待檢菌株，均能正確地鑒定到屬水平，87.7%的菌株鑒定到種水平。楊祖順等[29]取自不同類食品來源的、共210株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，采用MALDI-TOF MS對其進行鑒定，98.10%的菌株鑒定到種水平。Lucas等[30]利用MALDI-TOF MS成功得到大豆中根瘤菌(Bradyrhizobium)的指紋譜圖。

3.1.2 臨床微生物鑒定

Li等[22]通過meta分析研究了覆蓋6685株厭氧菌的質譜法鑒定，得到結論如下：84%的菌鑒定到種(I2= 98.0%，P<0.1)，92%的菌鑒定到屬(I2=96.6%，P<0.1)，準確率由高到低分別為：擬桿菌(Bacteroides)、乳桿菌(Lactobacillus)、副擬桿菌(Parabacteroides)、梭菌(Clostridium)等，然而，稀有厭氧菌的準確率偏低。李進等[31]利用MALDI-TOF MS檢測258株金屬酶銅綠假單胞菌(metallo-β-lactamasePseudomonasaeruginosa)，識別VIM型菌株的靈敏度為92.0%、特異性為100.0%，陽性預測值為100.0%，而SPM型菌株的靈敏度為80.0%，特異性為100.0%，陽性預測值均為100.0%。沈佳瑾等[32]收集32株大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)和28株肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，利用MALDI-TOF MS均能快速鑒別耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae)。吳思穎等[33]利用MALDI-TOF MS快速鑒定新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)和格特隱球菌(C.gattii)，并能夠區分新生隱球菌和格特隱球菌的不同基因型。

3.1.3 養殖過程中微生物鑒定

徐淑菲等[34]用MALDI-TOF MS檢測進口甲魚卵中攜帶病原菌，能夠分離并鑒定出綠膿桿菌(P.aeruginosa)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、肺炎克雷伯氏菌、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、沙門氏菌(Salmonella)等242株致病菌。李楠等[35]分析豬場中分離自空氣的微生物并鑒定，包括芽孢桿菌、微球菌、短桿菌、葡萄球菌在內的210株菌，91%被準確鑒定到種水平，95.7%被準確鑒定到屬水平。Barcelos等[36]從牛中分離186株可能與乳腺炎相關的細菌，對比了兩種提取方法并使用MALDI-TOF MS鑒定。

3.2 MALDI-TOF MS技術在真菌鑒定方面的應用

在糧油與食品領域，真菌及其毒素污染始終是關乎食品安全的重點。相對于多數細菌，真菌對水活度的要求相對低，易在糧油與食品中生長；但真菌的準確、快速鑒定卻要比細菌復雜得多。

3.2.1 酵母菌鑒定

MALDI-TOF MS在真菌領域最早應用于鑒定酵母菌，并在常見酵母菌鑒定中有著很高的穩定性和準確性[5]。Elsa等[37]鑒定了8株釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，均準確地鑒定到種水平。楊丹等[38]評估了真菌顯色培養基及培養時間對假絲酵母菌在MALDI-TOF MS鑒定結果中的影響。楊靜等[39]評價外陰陰道假絲酵母菌的鑒定精確性，包括白假絲酵母、非洲假絲酵母(C.africans)、都柏林假絲酵母(C.dublin)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、阿薩希絲孢酵母(Trichosporonasahii)等在內的314株，正確率為96.91%。張博筠等[40]的結果顯示質譜鑒定酵母菌準確率為97.7%，而API ID 32C系統鑒定準確率為93.0%，有顯著差異(χ2=9.439，P=0.002)；MALDI-TOF MS與ITS測序相比并無統計學差異。

3.2.2 絲狀真菌鑒定

相比酵母菌，絲狀真菌的鑒定顯然更為復雜，無論傳統方法還是基因測序，對實驗人員知識和技能、時間和成本等都有更高要求，但MALDI-TOF MS鑒定很大程度規避了前者的缺點，同時達到很高的準確率。張偉錚等[41]對臨床分離的254株絲狀真菌完成鑒定，MALDI-TOF MS的總體準確率為 86.36%，對毛癬菌屬(Trichophyton)、毛孢子菌屬、毛霉菌屬、曲霉菌屬準確率很高，但對犬小孢子菌(Microsporumcaninum)、鐮刀菌屬、新月彎孢霉(Curvularialunata)準確率較低。張桂等[42]采用直接涂靶法(質譜直涂法)快速鑒定133株絲狀真菌，質譜直涂法與另外兩種方法(基因序列分析與形態學鑒定)的種、復合群和屬的差異無統計學意義(χ2值分別為0.611、0.625、2.728和0.516、0.915、1.206，P>0.05)。吳友偉等[43]以102株絲狀真菌為供試樣品，采用Kappa值方法對質譜鑒定與形態學方法鑒定結果進行統計分析，認為MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑒定正確性與時效性優于形態學方法。王慶玲[44]發現67株絲狀真菌MALDI-TOF MS的鑒定結果，與形態學鑒定和分子生物學鑒定結果基本一致，在屬、種水平鑒定的總一致率分別為98.5%與94.1%，其中，曲霉菌—屬鑒定種水平的一致率達到100%。

4 結論與展望

MALDI-TOF MS技術是微生物快速鑒定的有效方法之一。MALDI-TOF MS技術與其他鑒定方法相比，原理不盡相同、各有所長，但具有快速、簡便、準確的優點。目前，MALDI-TOF MS技術亦有其使用極限，比如它還不能區分志賀氏菌和埃希氏大腸桿菌、百日咳桿菌(Bordetellapertussis)和 支氣管敗血鮑特菌(B.branchiseptica)、木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)和魯蘭無色桿菌(A.ruhlandii)、諾迪擬桿菌(B.nordii)和沙雷伯氏桿菌(B.salyersiae)、6種親緣關系近的腸桿菌(Enterobacterasburiae,E.cloacae,E.hormaechei,E.kobei,E.ludwigii,andE.nimipressuralis)、不同血清型的沙門氏菌、及蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)與蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)和蕈狀芽胞桿菌(B.mycoides)[2，29]。正是由于微生物間相似的遺傳背景或蛋白表達差異不大等原因，質譜信號并不能清晰分辨菌種間差異；加之儀器昂貴、真菌數據庫參考菌株少，故MALDI-TOF MS技術目前還不可能完全替代傳統的微生物鑒定技術，但它是微生物鑒定中較好的補充方法。

MALDI-TOF MS技術在糧油與食品微生物快速鑒定中有廣闊的應用空間。成熟的微生物鑒定手段和先進的鑒定設備已經在各糧油檢驗機構或科研機構普遍使用，但糧油與食品微生物的快速、準確鑒定方面仍存不足之處。這其中有技術本身的原因，比如16S rRNA基因測序(全步驟)、Biolog微生物鑒定系統和MIDI全脂肪酸鑒定系統的實際平均用時分別在24、24及2h/樣品，而MALDI-TOF MS平均用時10～20 min/樣品。同時，糧油微生物中絲狀真菌多，區分產毒菌株和非產毒菌株是快速鑒定的重點，依賴蛋白分析的MALDI-TOF MS技術可能成為有效的解決手段之一。

MALDI-TOF MS技術作為近些年已廣泛用于微生物鑒定的新技術，具有高通量、成本低、精確性高的特點，其結果的可靠性和精密度已被大量的研究所證明。未來，通過不斷地開發針對糧油與食品樣品的檢測方法并逐步完善菌株質譜數據庫，MALDI-TOF MS技術在糧油與食品微生物的快速鑒定領域必然有更為廣闊的應用空間。