響應面法優化鷹嘴豆異黃酮提取工藝分析

蔣變玲，許雪華，孟康，常冉，陳瓊，韓方凱，段紅

（宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000）

鷹嘴豆(Cicer arietinum L)，別名雞豌豆、桃豆，是重要的食用豆類之一，它起源于中東，印度是其最大的生產國，在我國西北部廣泛種植[1-3]。鷹嘴豆中含有豐富的營養物質，世界范圍內需求量大[4]。

異黃酮是豆科植物家族特有的一類酚類次級代謝產物，包括鷹嘴豆、大豆、豌豆、蠶豆和扁豆等谷物食品和飼料植物[1]。鷹嘴豆異黃酮具有多種生物活性以及保健功能，其中包括降低心血管疾病和癌癥的發病風險，抗氧化自由基、治療高脂血癥和糖尿病等[5]。但自然界中的異黃酮含量十分有限，而鷹嘴豆中異黃酮含量十分豐富（0.15～0.53 mg/g），是理想的提取原料[6-8]。

目前，異黃酮的提取方法大多采用溶劑萃取并加以微波、超聲波等方法聯合提取[9]。而酶法是一種新的提取方法，它通過纖維素酶分解樣品細胞壁，從而使細胞壁破壞，降低傳質阻力，使內容物更易流出[10]。此方法優點眾多，酶的結合位點在適當功率的超聲波的振蕩、空化等作用下發生變化，一定程度上能提高纖維素酶的活性，利用超聲波聯合酶解，能縮短酶解時間[11]。利用超聲聯合酶法提取鷹嘴豆異黃酮，此前未見報導。因此本研究采用脂鷹嘴豆生豆粉為原料，利用超聲聯合纖維素酶法提取鷹嘴豆生豆粉中的異黃酮，在單因素試驗基礎上，選出3個顯著因素通過響應面軟件進行優化，得出最佳條件。旨在為從鷹嘴豆中高效提取異黃酮提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；HH-S型恒溫超聲鍋，國勝實驗儀器廠；FA1104B型分析天平，上海越平科學儀器有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHZ-D型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；UV-5100H型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

鷹嘴豆生豆粉，新疆天山奇豆生物科技有限公司；鷹嘴豆芽素A標準品，上海如吉生物科技有限公司；纖維素酶（綠色木酶，5.0×104U/g），上海源葉生物。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的建立

參照溫海超等[6]方法，將1.0mg鷹嘴豆芽素A標準品用少量70%乙醇完全溶解，定容至10 mL。再將其梯度稀釋成0、0.000 2、0.000 5、0.001 0、0.001 5、0.002 0 mg/mL標準待測夜。在波長241、261、281 nm下測其吸光度值，以校正吸光度值ΔA為縱坐標，鷹嘴豆芽素A為橫坐標繪制標準曲線，其中ΔA的計算公式如下

1.3.2 異黃酮提取量的測定

原料預處理：鷹嘴豆生豆粉于50℃干燥箱中烘干至恒重，過40目篩備用。

鷹嘴豆異黃酮含量測定：準確稱取1.0 g鷹嘴豆生豆粉置于具塞錐形瓶中，以35%乙醇溶液為酶解液，加入不同量的纖維酶，在不同超聲溫度、超聲時間和液料比條件下進行酶解，反應完成后向錐形瓶中加入一定量的無水乙醇至最終乙醇濃度為65%以終止酶解反應，放入超聲波清洗機中提取20 min，抽濾后定容至100 mL，取1 mL稀釋10倍，測其吸光度值，鷹嘴豆異黃酮提取量的公式為

式中：C為根據鷹嘴豆芽素A計算得到的異黃酮濃度（μg/mL），V為定容體積（mL），N為稀釋倍數，M為鷹嘴豆生豆粉質量（g）。

1.3.3 單因素實驗

1.3.3.1 酶添加量對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

控制其他實驗條件一致，選取超聲溫度55℃，超聲時間60 min，液料比30∶1，乙醇濃度35%，考察不同酶添加量（以U/g底物表示，200、250、300、350、400 U/g）對鷹嘴豆異黃酮提取量影響。

1.3.3.2 超聲溫度對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

控制其他實驗條件一致，選取超聲時間60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比30∶1，乙醇濃度35%，考察不同超聲溫度（45、50、55、60、65℃）對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響。

1.3.3.3 超聲時間對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

控制其他實驗條件一致，選取超聲溫度55℃，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比30∶1，乙醇濃度35%，考察不同超聲時間（30、45、60、75、90 min）對鷹嘴豆異黃酮提取量影響。

1.3.3.4 酶解液液料比對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

其他實驗條件一致，選取超聲溫度為55℃，超聲時間為60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，乙醇濃度35%，考察不同液料比（表示為酶解液/樣品，10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）對鷹嘴豆異黃酮提取量影響。

1.3.3.5 乙醇濃度對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

其他實驗條件一致，選取超聲溫度為55℃，超聲時間為60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比為30∶1，考察不同乙醇濃度（25%、35%、45%、55%、65%）對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響。

1.3.3.6 超聲功率對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

其他實驗條件一致，選取超聲溫度為55℃，超聲時間為60 min，纖維素酶加入量為300 U/g，液料比為30∶1，乙醇濃度35%，考察不同功率（60、70、80、90、100 W）對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響。

1.3.4 響應面實驗設計

經SPSS軟件進行單因素方差分析，選取對鷹嘴豆異黃酮提取量影響較大的3個因素進行優化。響應面實驗設計見表1。

表1 響應面實驗設計Tab.1 Response surface test design

1.3.5 數據處理

利用Design-Expert 8.0和SPSS對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

圖1 鷹嘴豆芽素A標準曲線Fig.1 Chickpea A standard curve

以標準品濃度和相應吸光度值為橫、縱坐標，得到回歸方程

2.2 單因素實驗結果分析

2.2.1 纖維素酶使用量對鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖2可知，纖維素酶使用量在200～300 U/g范圍內，鷹嘴豆中異黃酮的提取量逐漸增加，這是由于隨著酶添加量增加，其對鷹嘴豆細胞壁的作用逐漸增強，細胞壁通透性增大，異黃酮類物質更易流出，鷹嘴豆異黃酮提取量增加[10]；當纖維素酶添加量為300 U/g時，異黃酮提取量達到最大，為1.25 mg/g；繼續增加纖維素酶的使用量，由于其會包裹住鷹嘴豆生豆粉顆粒，使鷹嘴豆異黃酮類物質難以溶出[12]，鷹嘴豆異黃酮提取量下降。酶添加量不宜過多，故選取250、300、350 U/g進行優化。

圖2 酶添加量對鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.2 Effects of enzyme addition on the extraction of isoflavones

2.2.2 超聲溫度對鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖3可知，超聲溫度低于55℃時，隨著溫度升高，鷹嘴豆異黃酮的提取量逐漸增加；超聲溫度大于55℃時，鷹嘴豆異黃酮的提取量逐漸減小。這是由于隨著溫度的增加，纖維素酶活性逐漸增大，酶解反應加快，異黃酮類物質溶出量增多，溫度繼續升高，纖維素酶肽鏈結構改變，生理活性降低，酶逐漸變性失活[13]，鷹嘴豆異黃酮的提取量下降。超聲溫度不宜過高，故選取50、55、60℃進行優化。

圖3 超聲溫度對鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.3 Effects of ultrasonic enzymatic hydrolysis temperature on the extraction of isoflavones

2.2.3 超聲時間對鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖4可知，當超聲時間小于60 min時，鷹嘴豆異黃酮的提取量增加；當超聲時間大于60 min時，鷹嘴豆異黃酮的提取量逐漸減小。隨著時間的增加，酶解反應趨于完全，且纖維素酶活性下降，粘液等雜質也會溶出[14]，影響鷹嘴豆異黃酮提取量，使鷹嘴豆異黃酮提取量下降，故選取45、60、75 min優化。

圖4 超聲時間對鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.4 Effects of ultrasonic enzymatic hydrolysis time on the extraction of isoflavones

2.2.4 酶解液液料比對鷹嘴豆異黃酮提取量影響

由圖5可以看出，酶解液液料比在10∶1～30∶1之間，鷹嘴豆異黃酮的提取量增加；當酶解液液料比大于30∶1時，鷹嘴豆異黃酮提取量減少。這是由于液料比升高，增大了鷹嘴豆生豆粉與纖維素酶的接觸面積，加快了酶促反應速率，鷹嘴豆異黃酮溶出量增加[15]。而當酶解液液料比大于30∶1時，隨著溶劑的增加，可能使其他物質溶出，進而影響到鷹嘴豆異黃酮的提取量。

圖5 液料比對鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.5 Effects of ratio of material to liquid on the extraction of flavonoids

2.2.5 乙醇濃度對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

由圖6可知，當酶解液的乙醇濃度在25%～35%之間時，鷹嘴豆異黃酮的提取量有稍微上升趨勢；當乙醇濃度在35%～55%之間，鷹嘴豆異黃酮的提取量顯著降低；當乙醇濃度在55%～65%范圍，鷹嘴豆異黃酮的提取量趨于平緩，推測乙醇濃度的增加會影響酶的活性，當乙醇濃度在65%時，纖維素酶幾乎完全失活。這與劉長嬌等人[16]報道較為一致。

圖6 乙醇濃度對鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.6 Effectsof ethanol concentration on theextraction of flavonoids

2.2.5 超聲功率對鷹嘴豆異黃酮提取量的影響

由圖6可知，高大維等[17]報道超聲功率對纖維素的活性有一定的影響。本文發現，隨超聲功率的增加，鷹嘴豆異黃酮的含量呈波動時下降，在超聲功率為80 W時，異黃酮提取量最高為1.34 mg/g，而后顯著下降。

2.3 響應面實驗結果與分析

2.3.1 響應面實驗結果分析

響應面實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Tab.2 Response surface test design and results

根據Design-Expert 8.0軟件對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合，擬合得到方程為

2.3.2 方差分析

由表3可知，實驗設計模型P＜0.01，差異極具有統計學意義。鷹嘴豆異黃酮提取量與3個變量之間有良好的一致性。失擬項P=0.268 4＞0.05，模型失擬，不具有統計學意義，表明能充分反映實際情況。決定系數R2=0.965 5，說明該模型優化的響應值真實可靠，本模型可以用于對鷹嘴豆異黃酮提取量進行分析和預測。通過表3實驗結果可知，C、A2、B2對鷹嘴豆異黃酮提取量影響極具有統計學意義。由F值可知，超聲時間對鷹嘴豆異黃酮提取量影響最大，酶添加量次之，超聲溫度影響最小。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.3.3 響應面分析

根據響應面曲面圖中曲線坡度的陡峭程度，判斷各因素對提取量的影響大小[18]。由表3結合圖6，圖7和圖8可知，AB、AC、BC之間交互作用均不顯著。

圖6 酶添加量與超聲溫度對鷹嘴豆異黃酮提取量影響曲面圖Fig.6 Effect of enzyme addition amount and ultrasonic enzymatic hydrolysis temperature on the extraction of isoflavones

圖7 超聲功率對鷹嘴豆異黃酮提取量影響Fig.7 Effects of ultrasonic power on the extraction of flavonoids

圖7 酶添加量與超聲時間對鷹嘴豆異黃酮提取量影響曲面圖Fig.7 Effect of enzyme addition amount and ultrasonic enzymatic hydrolysis time on the extraction of isoflavones

圖8 超聲溫度酶解與時間對鷹嘴豆異黃酮提取量影響曲面圖Fig.8 Ultrasonic enzymatic hydrolysis enzymatic hydrolysis and time on the isoflavone extraction amount

2.3.4 驗證實驗

利用Design-Expert 8.0軟件進行分析，鷹嘴豆異黃酮提取量的最佳條件為：酶添加量6.122 mg/g、酶解液30 mL，55.21℃超聲處理44.96 min，在此條件下鷹嘴豆異黃酮提取量為1.320 24 mg/g。為便于實際操作，修正實驗條件為纖維素酶添加量6.1 mg/g、液液料比1∶30，55℃超聲處理45 min。在此條件下重復3次，測得鷹嘴豆異黃酮提取量為1.320 24 mg/g，與預測值1.320 76 mg/g接近，證明所得實驗結果可靠。本文所得異黃酮提取量高于溫海超等[6]（0.150 7 mg/g）、吳敏等[7]（0.529 mg/g）以及程珍等[8]（0.16 mg/g）所測得的鷹嘴豆中異黃酮含量，因此本實驗的鷹嘴豆異黃酮提取率高于傳統方法。

3 結論與討論

異黃酮的提取方法較多，酶法主要采用纖維素酶使植物組織細胞受到破壞，進而降低細胞壁傳質阻力，提高提取效率[6]。大量研究表明，超聲聯合酶法對鷹嘴豆異黃酮及黃酮的提取效率優于同等條件下超聲波、纖維素酶單獨提取效率，且高于傳統提取方法[19-21]。

超聲聯合纖維素酶法提取鷹嘴豆異黃酮。結果表明，酶添加量306.03 U/g，液料比30∶1，55.21℃超聲處理45 min為最佳條件，在這些條件下鷹嘴豆異黃酮的提取量為1.320 24 mg/g，接近預測理論值。與傳統方法相比，該方法顯著提高了鷹嘴豆異黃酮的提取量，且該提取工藝操作簡便、安全環保，有很好的應用前景，為鷹嘴豆異黃酮的提取提供一定的參考。