臭氧對杏果實黑斑病的抑制及貯藏保鮮作用

李 玲，李 智，石 玲，李亞玲，何 歡，張亞琳，蘆玉佳，朱 璇

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）屬薔薇科杏屬，是中國原產果樹之一，其風味獨特，深受廣大消費者的喜愛[1]。據2018年數據統計，新疆杏樹種植面積約為11.13萬 hm2，占全疆果樹種植面積的11.66%，杏果實產量為93.3萬 t，是疆內果品總量的9%[2]。杏是典型的呼吸躍變型果實，在采后貯運過程中極易受到病原微生物侵染而腐爛變質，其中由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病是杏果實主要的采后病害，可能造成嚴重的采后損失[3]。目前，國內外主要通過化學藥劑控制杏果實采后病害，但在實踐中化學殺菌劑往往存在過量使用的情況，導致藥物殘留、病原菌產生耐藥性和環境污染等問題[4-5]。因此，需要尋求一種安全、綠色和有效的杏果實貯藏技術。

臭氧作為一種綠色、安全的殺菌劑，2001年被美國食品藥品管理局列入可直接接觸食物的消毒劑[6-7]。有研究表明，臭氧對于真菌、酵母菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌等各種致病菌都具有極強的滅菌功效[8]。近年來，臭氧也被應用于果蔬貯藏保鮮[9-10]，一方面臭氧可以直接抑制病原真菌的菌絲生長與孢子萌發[11-12]；另一方面臭氧作為一種強氧化劑，可通過氧化乙烯抑制果實的呼吸作用，延緩果蔬的衰老[13]；同時臭氧作為一種誘發因子，可以誘導增強果蔬采后抗病性[14-15]。

目前，許多研究表明臭氧不僅能夠降低獼猴桃的病害發生率[16-17]，提高草莓[18]和木瓜[19]的品質，還能延緩甜瓜[20]、芒果[21]的軟化和成熟，但關于臭氧通過調控苯丙烷代謝與杏果實抗病性關系的相關報道較少。因此，本實驗以‘賽買提’杏為材料，采用不同劑量的臭氧對接種A. alternata的杏果實進行熏蒸處理，探究杏果實抗病性與臭氧調控苯丙烷代謝的關系，為杏果實的貯藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘賽買提’杏果實，2019年6月22日采自新疆庫車縣烏恰鎮杏果園，選取無蟲害、無損傷、色澤和大小均勻、可溶性固形物質量分數為12%～13%、硬度為（18.0±0.5）N的杏果實為實驗果，當天運回新疆農業大學果品采后生理貯運研究室后，預冷24 h。

菌種A. alternata由新疆農業大學微生物實驗室提供。

β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、幾丁質、羥胺鹽酸、N-乙酰葡萄糖胺、脫鹽蝸牛酶、昆布多糖、肉桂酸、氧化型輔酶II、葡萄糖-6-磷酸鈉、p-香豆酸、ATP、輔酶A等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SKY2000系列氣體檢測報警儀深圳市元特科技有限公司；HY-004S-4A臭氧發生器廣州佳環電器科技有限公司；3H16RI智能高速冷凍離心機湖南赫西儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋北京市永光明醫療儀器有限公司；UV-1700型紫外-可見分光光度計上海美析儀器有限公司；SW-CJ-1W潔凈工作臺上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 損傷接種

參照石玲等[22]的方法并稍作修改。取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基培養7 d的A. alternata，加入20 mL含0.05%（體積分數，后同）Tween-80的無菌水，用無菌藥匙刮下PDA培養基上的孢子，轉移到50 mL三角瓶內，搖晃混勻后用紗布濾除大塊絮狀物，用0.05% Tween-80溶液將孢子懸浮液濃度調節至1×106個/mL。用無菌水和75%乙醇溶液先后擦拭果實表面，晾干后用滅菌鐵釘在果實赤道部位刺1 個直徑為2.5 mm、深度為4 mm的孔，向孔內注入15 μL的孢子懸浮液，將接種的一面豎直向上放置，接種后的杏果實進行臭氧處理。

1.3.2 原料處理與分組

臭氧處理在預實驗的基礎上參照劉路[23]的方法進行。將200 mg/m3的臭氧氣體充入體積為70 L的密封箱中，下通氣口進氣，上通氣口用臭氧濃度檢測儀檢測，充氣到達指定濃度并穩定后，密閉熏蒸30 min，采用間歇熏蒸方法，每7 d處理一次杏果實。以密封箱不通入臭氧氣體的杏果實為對照組，密閉放置30 min，每個處理3 組平行，每組處理3 kg杏果實。熏蒸后置于冷庫（1～2 ℃、相對濕度90%～95%）中貯藏。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 病斑直徑及接種發病率的測定

以單個杏果實病斑直徑達4 mm以上計為發病果實，用十字交叉法測定貯藏期杏果實的病斑直徑，發病率按下式計算。

1.3.3.2 苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酸輔酶A連接酶活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力的測定：參考曹建康等[24]的方法，以每克鮮果每小時在290 nm波長處吸光度變化0.01為1 個PAL活力單位（U）。

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumaric acid CoA ligase，4CL）活力的測定參考范存斐等[25]的方法，以每克鮮果每小時在340 nm波長處吸光度變化0.01為1 個C4H活力單位（U），以每克鮮果每小時在333 nm波長處吸光度變化0.01為1 個4CL活力單位（U）。

以上酶活力單位均為U/（h·g）。

1.3.3.3β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶活力的測定

β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）、幾丁質酶（chitinase，CHT）活力測定參照曹建康等[24]的方法。以每秒鐘每克鮮果中酶分解昆布多糖產生1×10-4mol葡萄糖為一個β-1,3-葡聚糖酶活力單位，以每秒鐘每克鮮果中酶分解膠狀幾丁質產生1×10-4molN-乙酰葡萄糖胺為一個幾丁質酶活力單位。Glu、CHT活力單位均為10-4mol/（s·g）。

1.3.3.4 總酚和類黃酮含量的測定

總酚和類黃酮含量的測定參照曹建康等[24]的方法。以每克鮮果在波長280 nm處光密度值表示總酚含量；以每克鮮果在波長325 nm處光密度值表示類黃酮物質含量。

1.4 數據處理分析

利用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析，采用Duncan檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 臭氧處理對接種A. alternata杏果實病斑直徑和接種發病率的影響

圖 1 臭氧處理對損傷接種A. alternata杏果實病斑直徑（A）和發病率（B）的影響Fig. 1 Effect of ozone treatment on lesion diameter (A) and the incidence of black spot disease (B) in apricot fruit inoculated with A. alternata

如圖1A所示，杏果實損傷接種A. alternata后，杏果實病斑直徑在整個貯藏期間呈現不斷上升的趨勢，但臭氧處理組的杏果實病斑直徑始終低于對照組，且在貯藏21 d后，兩組間杏果實的病斑直徑呈現出顯著差異（P＜0.05）。如圖1B所示，杏果實接種發病率隨著貯藏時間的延長而呈現逐漸上升趨勢，在貯藏第7天時，臭氧處理組損傷接種的杏果實無發病現象，而對照組損傷接種的杏果實已經發病。貯藏結束時，臭氧處理的果實接種發病率比對照低14.07%（P＜0.05）。說明臭氧處理可明顯抑制杏果實病斑直徑的擴大和降低杏果實接種發病率。

2.2 臭氧處理對杏果實貯藏過程中PAL活力的影響

圖 2 臭氧處理對杏果實貯藏過程中PAL活力的影響Fig. 2 Effect of ozone treatment on PAL activity in apricot fruit

PAL作為苯丙烷代謝中的關鍵酶，與植物的抗病性關系密切[26]。從圖2可知，臭氧處理組和對照組的杏果實PAL活力都是呈先上升后下降趨勢，但在整個貯藏期內，臭氧處理組的杏果實PAL活力顯著高于對照組的。在貯藏14 d時，臭氧處理組和對照組的PAL活力都達到峰值，其中臭氧處理組PAL活力是對照組的1.53 倍（P＜0.05）。貯藏結束時，臭氧處理組PAL活力是對照組的4.94 倍（P＜0.05），表明臭氧可以有效減緩杏果實的PAL活力降低，提高杏果實抗病性。

2.3 臭氧處理對杏果實貯藏過程中C4H活力的影響

圖 3 臭氧處理對杏果實貯藏過程中C4H活力的影響Fig. 3 Effect of ozone treatment on C4H activity in apricot fruit

由圖3可發現，在貯藏的0～28 d，臭氧處理組和對照組的杏果實C4H活力均呈上升趨勢，無明顯差異。但在貯藏28 d后，對照組的C4H活力逐漸下降，臭氧處理組的C4H活力仍繼續上升，且在貯藏42 d達到峰值，與對照組相比差異顯著。在貯藏結束時，臭氧處理組C4H活力是對照組的1.16 倍（P＜0.05）。

2.4 臭氧處理對杏果實貯藏過程中4CL活力的影響

如圖4所示，在貯藏期間，對照組的杏果實4CL活力呈緩慢下降趨勢，而臭氧處理組的4CL活力總體呈現先上升后下降的趨勢，臭氧處理杏果實的4CL活力始終顯著高于對照杏果實。貯藏第35天時，臭氧處理組的4CL活力達到峰值，是此時對照組的1.62 倍（P＜0.05）。在貯藏35 d后，臭氧處理組杏果實的4CL活力下降，但始終顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖 4 臭氧處理對杏果實貯藏過程中4CL活力的影響Fig. 4 Effect of ozone treatment on 4CL activity in apricot fruit

2.5 臭氧處理對杏果實貯藏過程中GLU活力的影響

圖 5 臭氧處理對杏果實貯藏過程中GLU活力的影響Fig. 5 Effect of ozone treatment on GLU activity in apricot fruit

GLU是重要的病程蛋白，對病原菌有直接的殺菌作用[27]。由圖5可知，對照組和臭氧處理組的杏果實GLU活力整體上均先升高后下降，但在貯藏期間，臭氧處理組的GLU活力顯著高于對照組。在貯藏21 d時，對照組的GLU活力達到峰值，而臭氧處理組在第7天就達峰值，一直維持到21 d后才開始下降，在第21天時，臭氧處理組的GLU活力是對照組的1.66 倍（P＜0.05）。在貯藏21 d后，對照組和臭氧處理組的杏果實GLU活力均呈下降趨勢，但臭氧處理組的GLU活力始終顯著高于對照組，說明臭氧處理可以延緩杏果實GLU活力下降，增強杏果實對病害的抵御能力。

2.6 臭氧處理對杏果實貯藏過程中CHT活力的影響

圖 6 臭氧處理對杏果實貯藏過程中CHT活力的影響Fig. 6 Effect of ozone treatment on CHT activity in apricot fruit

如圖6所示，處理組和對照組的杏果實貯藏過程中CHT活力均呈先上升后下降的趨勢。在貯藏42 d時，臭氧處理組和對照的貯藏過程中CHT活力均達到峰值，其中臭氧處理組的貯藏過程中CHT活力是對照組的1.58 倍（P＜0.05）。在第49天時，兩組貯藏過程中CHT活力都下降，其中臭氧處理組的貯藏過程中CHT活力顯著是對照組的1.73 倍（P＜0.05）。

2.7 臭氧處理對杏果實貯藏過程中總酚和類黃酮含量的影響

圖 7 臭氧處理對杏果實貯藏過程中總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig. 7 Effect of ozone treatment on total phenolic (A) and flavonoid (B)contents in apricot fruit

由圖7A可知，在貯藏期間，臭氧處理組和對照組的總酚含量均呈先上升后下降趨勢，臭氧處理組的杏果實總酚含量比對照組高。在貯藏35 d時，對照組出現峰值，而臭氧處理組在貯藏42 d時出現峰值。貯藏結束時，臭氧處理組總酚含量比對照組高8.9%（P＜0.05）。

如圖7B所示，在貯藏期間，臭氧處理組的杏果實類黃酮含量呈現上升趨勢，對照組果實的類黃酮含量呈波動上升趨勢，但臭氧處理組的杏果實類黃酮含量整體上顯著高于對照組。在貯藏21 d時，臭氧處理組的杏果實類黃酮比對照組高12.20%（P＜0.05）。貯藏第49天，臭氧處理組的類黃酮含量是對照組的1.15 倍（P＜0.05）。

3 討 論

已有的研究結果表明，適宜濃度的臭氧處理可以有效抑制果蔬采后病害的發生[13]。本實驗結果表明，200 mg/m3臭氧處理能有效抑制杏果實病斑直徑的擴展，顯著降低杏果實損傷接種發病率。郭宇歡等[28]研究發現90 μL/L臭氧處理葡萄15 min，可明顯降低‘紅地球’葡萄灰霉病的發病率。臭氧處理能夠抑制果蔬采后病害的發病，一方面是因為臭氧處理可以直接抑制病原真菌的菌絲生長和孢子萌發。Luo Anwei等[17]對獼猴桃的研究指出，適宜濃度的臭氧處理能夠有效抑制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和擴展青霉（Penicillium expansum）的菌絲生長和孢子萌發。García-Martín等[29]對柑橘的研究表明，1.6 mg/kg臭氧處理可以顯著抑制指狀青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）的菌絲生長。另一方面，臭氧增強果蔬的抗病性可能與調控抗病相關代謝途徑有關[13,30]。苯丙烷代謝途徑是果蔬抗病反應中的關鍵代謝途徑，PAL、C4H和4CL是催化苯丙烷代謝的關鍵酶。其中PAL作為苯丙烷代謝中的關鍵酶和限速酶，能夠促進合成抗菌物質如酚類、植保素等，植物的抗病性與這些物質密切相關[26]。C4H作為繼PAL之后苯丙烷代謝的又一關鍵酶，參與生成p-香豆酸，C4H活力的增強可促進酚酸類物質的合成，抑制病原菌的生長和繁殖[31]。4CL控制苯丙烷代謝主途徑向分支途徑的轉折[32]。本實驗結果表明，200 mg/m3臭氧處理顯著提高了杏果實PAL、C4H和4CL的活力。蘇苗[33]研究表明，臭氧降低獼猴桃病害的發生與PAL活力的增加相關。水楊酸和24-表油菜素內酯處理杏果實的研究也表明，其可以通過誘導杏果實PAL、C4H和4CL活力的升高，增強杏果實采后的抗病性[34-35]。說明臭氧處理增強杏果實抗病性與苯丙烷代謝的調控密切相關。

GLU和CHT是果蔬中的病程相關蛋白[36]，可以使真菌細胞壁受到損壞，抑制真菌的生長繁殖和提高植物的抗病害能力[27,37]。Luo Anwei等[17]研究表明，適宜劑量的臭氧處理增強獼猴桃的抗病性與GLU和CHT活力的提高密切相關。郭宇歡[38]對葡萄的研究發現，90 μL/L臭氧處理可以通過提高葡萄中GLU和CHT的活力，降低灰霉菌對葡萄的侵染。本實驗研究發現，200 mg/m3臭氧處理顯著提高杏果實GLU和CHT的活力，增強杏果實的抗病性，與上述研究結果相同。

總酚和類黃酮是苯丙烷類代謝途徑的最終產物。酚類物質自身具有抗病害能力，可抑制病原微生物的繁殖，同時又參與合成木質素，類黃酮則是重要的植保素，其含量反映了植物的抗病性[39]。本實驗結果表明，200 mg/m3臭氧處理有利于類黃酮和總酚的積累。Chen Cunkun等[40]指出，適宜濃度的臭氧處理可有效促進草莓總酚和類黃酮含量的積累，有助于提高草莓抗病性。Yeoh等[41]對鮮切木瓜的研究發現，9.2 μL/L臭氧處理20 min，臭氧處理組總酚含量的積累與鮮切木瓜抗病性的提高相關。綜上，總酚和類黃酮含量的積累是增強杏果實抗病性的重要因素之一。

本實驗表明，200 mg/m3臭氧處理能夠有效抑制病斑直徑的擴展和顯著降低杏果實的接種發病率，提高了杏果實的PAL、C4H、4CL、GLU和CHT活力及總酚和類黃酮的含量，表明臭氧可通過調控杏果實體內的苯丙烷代謝相關酶的活力，增強杏果實的抗病性。目前，臭氧作為一種低成本且綠色的采后處理，其應用前景廣泛，關于臭氧在果蔬采后領域的應用也越來越多，但臭氧的貯藏保鮮效果與貯藏的溫度、果蔬的品種、臭氧處理的劑量等多種因素有關，而且在實際操作過程中需要提高處理技術的安全性，因此，臭氧在大規模引用于商業貯藏前，很多工作還需完善。