臭氧對(duì)杏果實(shí)黑斑病的抑制及貯藏保鮮作用

李 玲，李 智，石 玲，李亞玲，何 歡，張亞琳，蘆玉佳，朱 璇

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）屬薔薇科杏屬，是中國原產(chǎn)果樹之一，其風(fēng)味獨(dú)特，深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。據(jù)2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，新疆杏樹種植面積約為11.13萬 hm2，占全疆果樹種植面積的11.66%，杏果實(shí)產(chǎn)量為93.3萬 t，是疆內(nèi)果品總量的9%[2]。杏是典型的呼吸躍變型果實(shí)，在采后貯運(yùn)過程中極易受到病原微生物侵染而腐爛變質(zhì)，其中由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病是杏果實(shí)主要的采后病害，可能造成嚴(yán)重的采后損失[3]。目前，國內(nèi)外主要通過化學(xué)藥劑控制杏果實(shí)采后病害，但在實(shí)踐中化學(xué)殺菌劑往往存在過量使用的情況，導(dǎo)致藥物殘留、病原菌產(chǎn)生耐藥性和環(huán)境污染等問題[4-5]。因此，需要尋求一種安全、綠色和有效的杏果實(shí)貯藏技術(shù)。

臭氧作為一種綠色、安全的殺菌劑，2001年被美國食品藥品管理局列入可直接接觸食物的消毒劑[6-7]。有研究表明，臭氧對(duì)于真菌、酵母菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌等各種致病菌都具有極強(qiáng)的滅菌功效[8]。近年來，臭氧也被應(yīng)用于果蔬貯藏保鮮[9-10]，一方面臭氧可以直接抑制病原真菌的菌絲生長與孢子萌發(fā)[11-12]；另一方面臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑，可通過氧化乙烯抑制果實(shí)的呼吸作用，延緩果蔬的衰老[13]；同時(shí)臭氧作為一種誘發(fā)因子，可以誘導(dǎo)增強(qiáng)果蔬采后抗病性[14-15]。

目前，許多研究表明臭氧不僅能夠降低獼猴桃的病害發(fā)生率[16-17]，提高草莓[18]和木瓜[19]的品質(zhì)，還能延緩甜瓜[20]、芒果[21]的軟化和成熟，但關(guān)于臭氧通過調(diào)控苯丙烷代謝與杏果實(shí)抗病性關(guān)系的相關(guān)報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以‘賽買提’杏為材料，采用不同劑量的臭氧對(duì)接種A. alternata的杏果實(shí)進(jìn)行熏蒸處理，探究杏果實(shí)抗病性與臭氧調(diào)控苯丙烷代謝的關(guān)系，為杏果實(shí)的貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘賽買提’杏果實(shí)，2019年6月22日采自新疆庫車縣烏恰鎮(zhèn)杏果園，選取無蟲害、無損傷、色澤和大小均勻、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%～13%、硬度為（18.0±0.5）N的杏果實(shí)為實(shí)驗(yàn)果，當(dāng)天運(yùn)回新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)果品采后生理貯運(yùn)研究室后，預(yù)冷24 h。

菌種A. alternata由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、幾丁質(zhì)、羥胺鹽酸、N-乙酰葡萄糖胺、脫鹽蝸牛酶、昆布多糖、肉桂酸、氧化型輔酶II、葡萄糖-6-磷酸鈉、p-香豆酸、ATP、輔酶A等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SKY2000系列氣體檢測(cè)報(bào)警儀深圳市元特科技有限公司；HY-004S-4A臭氧發(fā)生器廣州佳環(huán)電器科技有限公司；3H16RI智能高速冷凍離心機(jī)湖南赫西儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì)上海美析儀器有限公司；SW-CJ-1W潔凈工作臺(tái)上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 損傷接種

參照石玲等[22]的方法并稍作修改。取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的A. alternata，加入20 mL含0.05%（體積分?jǐn)?shù)，后同）Tween-80的無菌水，用無菌藥匙刮下PDA培養(yǎng)基上的孢子，轉(zhuǎn)移到50 mL三角瓶內(nèi)，搖晃混勻后用紗布濾除大塊絮狀物，用0.05% Tween-80溶液將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至1×106個(gè)/mL。用無菌水和75%乙醇溶液先后擦拭果實(shí)表面，晾干后用滅菌鐵釘在果實(shí)赤道部位刺1 個(gè)直徑為2.5 mm、深度為4 mm的孔，向孔內(nèi)注入15 μL的孢子懸浮液，將接種的一面豎直向上放置，接種后的杏果實(shí)進(jìn)行臭氧處理。

1.3.2 原料處理與分組

臭氧處理在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上參照劉路[23]的方法進(jìn)行。將200 mg/m3的臭氧氣體充入體積為70 L的密封箱中，下通氣口進(jìn)氣，上通氣口用臭氧濃度檢測(cè)儀檢測(cè)，充氣到達(dá)指定濃度并穩(wěn)定后，密閉熏蒸30 min，采用間歇熏蒸方法，每7 d處理一次杏果實(shí)。以密封箱不通入臭氧氣體的杏果實(shí)為對(duì)照組，密閉放置30 min，每個(gè)處理3 組平行，每組處理3 kg杏果實(shí)。熏蒸后置于冷庫（1～2 ℃、相對(duì)濕度90%～95%）中貯藏。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 病斑直徑及接種發(fā)病率的測(cè)定

以單個(gè)杏果實(shí)病斑直徑達(dá)4 mm以上計(jì)為發(fā)病果實(shí)，用十字交叉法測(cè)定貯藏期杏果實(shí)的病斑直徑，發(fā)病率按下式計(jì)算。

1.3.3.2 苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酸輔酶A連接酶活力的測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力的測(cè)定：參考曹建康等[24]的方法，以每克鮮果每小時(shí)在290 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)PAL活力單位（U）。

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumaric acid CoA ligase，4CL）活力的測(cè)定參考范存斐等[25]的方法，以每克鮮果每小時(shí)在340 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)C4H活力單位（U），以每克鮮果每小時(shí)在333 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)4CL活力單位（U）。

以上酶活力單位均為U/（h·g）。

1.3.3.3β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHT）活力測(cè)定參照曹建康等[24]的方法。以每秒鐘每克鮮果中酶分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-4mol葡萄糖為一個(gè)β-1,3-葡聚糖酶活力單位，以每秒鐘每克鮮果中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-4molN-乙酰葡萄糖胺為一個(gè)幾丁質(zhì)酶活力單位。Glu、CHT活力單位均為10-4mol/（s·g）。

1.3.3.4 總酚和類黃酮含量的測(cè)定

總酚和類黃酮含量的測(cè)定參照曹建康等[24]的方法。以每克鮮果在波長280 nm處光密度值表示總酚含量；以每克鮮果在波長325 nm處光密度值表示類黃酮物質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧處理對(duì)接種A. alternata杏果實(shí)病斑直徑和接種發(fā)病率的影響

圖 1 臭氧處理對(duì)損傷接種A. alternata杏果實(shí)病斑直徑（A）和發(fā)病率（B）的影響Fig. 1 Effect of ozone treatment on lesion diameter (A) and the incidence of black spot disease (B) in apricot fruit inoculated with A. alternata

如圖1A所示，杏果實(shí)損傷接種A. alternata后，杏果實(shí)病斑直徑在整個(gè)貯藏期間呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，但臭氧處理組的杏果實(shí)病斑直徑始終低于對(duì)照組，且在貯藏21 d后，兩組間杏果實(shí)的病斑直徑呈現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。如圖1B所示，杏果實(shí)接種發(fā)病率隨著貯藏時(shí)間的延長而呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，在貯藏第7天時(shí)，臭氧處理組損傷接種的杏果實(shí)無發(fā)病現(xiàn)象，而對(duì)照組損傷接種的杏果實(shí)已經(jīng)發(fā)病。貯藏結(jié)束時(shí)，臭氧處理的果實(shí)接種發(fā)病率比對(duì)照低14.07%（P＜0.05）。說明臭氧處理可明顯抑制杏果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)大和降低杏果實(shí)接種發(fā)病率。

2.2 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中PAL活力的影響

圖 2 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中PAL活力的影響Fig. 2 Effect of ozone treatment on PAL activity in apricot fruit

PAL作為苯丙烷代謝中的關(guān)鍵酶，與植物的抗病性關(guān)系密切[26]。從圖2可知，臭氧處理組和對(duì)照組的杏果實(shí)PAL活力都是呈先上升后下降趨勢(shì)，但在整個(gè)貯藏期內(nèi)，臭氧處理組的杏果實(shí)PAL活力顯著高于對(duì)照組的。在貯藏14 d時(shí)，臭氧處理組和對(duì)照組的PAL活力都達(dá)到峰值，其中臭氧處理組PAL活力是對(duì)照組的1.53 倍（P＜0.05）。貯藏結(jié)束時(shí)，臭氧處理組PAL活力是對(duì)照組的4.94 倍（P＜0.05），表明臭氧可以有效減緩杏果實(shí)的PAL活力降低，提高杏果實(shí)抗病性。

2.3 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中C4H活力的影響

圖 3 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中C4H活力的影響Fig. 3 Effect of ozone treatment on C4H activity in apricot fruit

由圖3可發(fā)現(xiàn)，在貯藏的0～28 d，臭氧處理組和對(duì)照組的杏果實(shí)C4H活力均呈上升趨勢(shì)，無明顯差異。但在貯藏28 d后，對(duì)照組的C4H活力逐漸下降，臭氧處理組的C4H活力仍繼續(xù)上升，且在貯藏42 d達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比差異顯著。在貯藏結(jié)束時(shí)，臭氧處理組C4H活力是對(duì)照組的1.16 倍（P＜0.05）。

2.4 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中4CL活力的影響

如圖4所示，在貯藏期間，對(duì)照組的杏果實(shí)4CL活力呈緩慢下降趨勢(shì)，而臭氧處理組的4CL活力總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，臭氧處理杏果實(shí)的4CL活力始終顯著高于對(duì)照杏果實(shí)。貯藏第35天時(shí)，臭氧處理組的4CL活力達(dá)到峰值，是此時(shí)對(duì)照組的1.62 倍（P＜0.05）。在貯藏35 d后，臭氧處理組杏果實(shí)的4CL活力下降，但始終顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖 4 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中4CL活力的影響Fig. 4 Effect of ozone treatment on 4CL activity in apricot fruit

2.5 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中GLU活力的影響

圖 5 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中GLU活力的影響Fig. 5 Effect of ozone treatment on GLU activity in apricot fruit

GLU是重要的病程蛋白，對(duì)病原菌有直接的殺菌作用[27]。由圖5可知，對(duì)照組和臭氧處理組的杏果實(shí)GLU活力整體上均先升高后下降，但在貯藏期間，臭氧處理組的GLU活力顯著高于對(duì)照組。在貯藏21 d時(shí)，對(duì)照組的GLU活力達(dá)到峰值，而臭氧處理組在第7天就達(dá)峰值，一直維持到21 d后才開始下降，在第21天時(shí)，臭氧處理組的GLU活力是對(duì)照組的1.66 倍（P＜0.05）。在貯藏21 d后，對(duì)照組和臭氧處理組的杏果實(shí)GLU活力均呈下降趨勢(shì)，但臭氧處理組的GLU活力始終顯著高于對(duì)照組，說明臭氧處理可以延緩杏果實(shí)GLU活力下降，增強(qiáng)杏果實(shí)對(duì)病害的抵御能力。

2.6 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中CHT活力的影響

圖 6 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中CHT活力的影響Fig. 6 Effect of ozone treatment on CHT activity in apricot fruit

如圖6所示，處理組和對(duì)照組的杏果實(shí)貯藏過程中CHT活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)。在貯藏42 d時(shí)，臭氧處理組和對(duì)照的貯藏過程中CHT活力均達(dá)到峰值，其中臭氧處理組的貯藏過程中CHT活力是對(duì)照組的1.58 倍（P＜0.05）。在第49天時(shí)，兩組貯藏過程中CHT活力都下降，其中臭氧處理組的貯藏過程中CHT活力顯著是對(duì)照組的1.73 倍（P＜0.05）。

2.7 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中總酚和類黃酮含量的影響

圖 7 臭氧處理對(duì)杏果實(shí)貯藏過程中總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig. 7 Effect of ozone treatment on total phenolic (A) and flavonoid (B)contents in apricot fruit

由圖7A可知，在貯藏期間，臭氧處理組和對(duì)照組的總酚含量均呈先上升后下降趨勢(shì)，臭氧處理組的杏果實(shí)總酚含量比對(duì)照組高。在貯藏35 d時(shí)，對(duì)照組出現(xiàn)峰值，而臭氧處理組在貯藏42 d時(shí)出現(xiàn)峰值。貯藏結(jié)束時(shí)，臭氧處理組總酚含量比對(duì)照組高8.9%（P＜0.05）。

如圖7B所示，在貯藏期間，臭氧處理組的杏果實(shí)類黃酮含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，對(duì)照組果實(shí)的類黃酮含量呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，但臭氧處理組的杏果實(shí)類黃酮含量整體上顯著高于對(duì)照組。在貯藏21 d時(shí)，臭氧處理組的杏果實(shí)類黃酮比對(duì)照組高12.20%（P＜0.05）。貯藏第49天，臭氧處理組的類黃酮含量是對(duì)照組的1.15 倍（P＜0.05）。

3 討 論

已有的研究結(jié)果表明，適宜濃度的臭氧處理可以有效抑制果蔬采后病害的發(fā)生[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，200 mg/m3臭氧處理能有效抑制杏果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)展，顯著降低杏果實(shí)損傷接種發(fā)病率。郭宇歡等[28]研究發(fā)現(xiàn)90 μL/L臭氧處理葡萄15 min，可明顯降低‘紅地球’葡萄灰霉病的發(fā)病率。臭氧處理能夠抑制果蔬采后病害的發(fā)病，一方面是因?yàn)槌粞跆幚砜梢灾苯右种撇≡婢木z生長和孢子萌發(fā)。Luo Anwei等[17]對(duì)獼猴桃的研究指出，適宜濃度的臭氧處理能夠有效抑制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）的菌絲生長和孢子萌發(fā)。García-Martín等[29]對(duì)柑橘的研究表明，1.6 mg/kg臭氧處理可以顯著抑制指狀青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）的菌絲生長。另一方面，臭氧增強(qiáng)果蔬的抗病性可能與調(diào)控抗病相關(guān)代謝途徑有關(guān)[13,30]。苯丙烷代謝途徑是果蔬抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵代謝途徑，PAL、C4H和4CL是催化苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶。其中PAL作為苯丙烷代謝中的關(guān)鍵酶和限速酶，能夠促進(jìn)合成抗菌物質(zhì)如酚類、植保素等，植物的抗病性與這些物質(zhì)密切相關(guān)[26]。C4H作為繼PAL之后苯丙烷代謝的又一關(guān)鍵酶，參與生成p-香豆酸，C4H活力的增強(qiáng)可促進(jìn)酚酸類物質(zhì)的合成，抑制病原菌的生長和繁殖[31]。4CL控制苯丙烷代謝主途徑向分支途徑的轉(zhuǎn)折[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，200 mg/m3臭氧處理顯著提高了杏果實(shí)PAL、C4H和4CL的活力。蘇苗[33]研究表明，臭氧降低獼猴桃病害的發(fā)生與PAL活力的增加相關(guān)。水楊酸和24-表油菜素內(nèi)酯處理杏果實(shí)的研究也表明，其可以通過誘導(dǎo)杏果實(shí)PAL、C4H和4CL活力的升高，增強(qiáng)杏果實(shí)采后的抗病性[34-35]。說明臭氧處理增強(qiáng)杏果實(shí)抗病性與苯丙烷代謝的調(diào)控密切相關(guān)。

GLU和CHT是果蔬中的病程相關(guān)蛋白[36]，可以使真菌細(xì)胞壁受到損壞，抑制真菌的生長繁殖和提高植物的抗病害能力[27,37]。Luo Anwei等[17]研究表明，適宜劑量的臭氧處理增強(qiáng)獼猴桃的抗病性與GLU和CHT活力的提高密切相關(guān)。郭宇歡[38]對(duì)葡萄的研究發(fā)現(xiàn)，90 μL/L臭氧處理可以通過提高葡萄中GLU和CHT的活力，降低灰霉菌對(duì)葡萄的侵染。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，200 mg/m3臭氧處理顯著提高杏果實(shí)GLU和CHT的活力，增強(qiáng)杏果實(shí)的抗病性，與上述研究結(jié)果相同。

總酚和類黃酮是苯丙烷類代謝途徑的最終產(chǎn)物。酚類物質(zhì)自身具有抗病害能力，可抑制病原微生物的繁殖，同時(shí)又參與合成木質(zhì)素，類黃酮?jiǎng)t是重要的植保素，其含量反映了植物的抗病性[39]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，200 mg/m3臭氧處理有利于類黃酮和總酚的積累。Chen Cunkun等[40]指出，適宜濃度的臭氧處理可有效促進(jìn)草莓總酚和類黃酮含量的積累，有助于提高草莓抗病性。Yeoh等[41]對(duì)鮮切木瓜的研究發(fā)現(xiàn)，9.2 μL/L臭氧處理20 min，臭氧處理組總酚含量的積累與鮮切木瓜抗病性的提高相關(guān)。綜上，總酚和類黃酮含量的積累是增強(qiáng)杏果實(shí)抗病性的重要因素之一。

本實(shí)驗(yàn)表明，200 mg/m3臭氧處理能夠有效抑制病斑直徑的擴(kuò)展和顯著降低杏果實(shí)的接種發(fā)病率，提高了杏果實(shí)的PAL、C4H、4CL、GLU和CHT活力及總酚和類黃酮的含量，表明臭氧可通過調(diào)控杏果實(shí)體內(nèi)的苯丙烷代謝相關(guān)酶的活力，增強(qiáng)杏果實(shí)的抗病性。目前，臭氧作為一種低成本且綠色的采后處理，其應(yīng)用前景廣泛，關(guān)于臭氧在果蔬采后領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多，但臭氧的貯藏保鮮效果與貯藏的溫度、果蔬的品種、臭氧處理的劑量等多種因素有關(guān)，而且在實(shí)際操作過程中需要提高處理技術(shù)的安全性，因此，臭氧在大規(guī)模引用于商業(yè)貯藏前，很多工作還需完善。