兩種乳酸桿菌對肥胖小鼠的干預作用

王 苗，張保杰，文佳嘉，胡婕倫，聶少平，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，中國-加拿大食品科學技術聯合實驗室，江西 南昌 330047）

肥胖是一種由多種危險因素（包括遺傳）引起的體內脂質過多的代謝綜合征[1]。近幾年，肥胖的發病率快速增加，大量流行病學調查顯示，肥胖是多種慢性疾病（如2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病、子宮內膜癌、乳腺癌等）的潛在誘因，全球死于肥胖及其繼發慢性代謝性疾病的人數與日俱增[2-4]。肥胖發生過程歷時較長，主要原因在于機體長期的能量攝入過多和代謝水平降低，繼而對脂肪的利用能力下降并導致脂肪在體內蓄積[5]。

目前干預和治療肥胖的方法主要有以下幾種：輕度肥胖時，可通過膳食干預（調整飲食結構）和運動干預（有效減少熱量的攝入以及通過一些運動等方式使能量的支出增加），這是臨床上和生活中尤為基礎的方法[6]。當肥胖癥狀嚴重到一定程度時，即體質量指數（body mass index，BMI）超過27 kg/m2或30 kg/m2且伴隨肥胖并發癥時，需要使用藥物進行輔助治療[7]。此外，肥胖外科手術也是減肥治療的一種常見方式，如國際糖尿病聯合會建議，對于BMI在30～35 kg/m2之間且一般藥物不能控制的人群，可采用外科手術方法[8]。隨著科技進步和經濟發展，近年來也出現一些比較新穎的減肥手段，如基因定向治療、靶點治療、糞菌移植等[9-10]。以上的減肥方式均存在一定的風險和不確定性。例如傳統的藥物治療會對人的神經系統及腎臟造成一定的損傷[11]；減肥手術存在一定的風險，且對身體影響較大；有些新穎的減肥方式缺乏充足的臨床實驗，安全性還有待進一步深究。因此，科學的膳食搭配加上適當的運動是目前較有效地維持和減輕體質量的健康生活方式[12]。

益生菌是活的微生物（在大多數情況下是細菌），這些細菌通常也被稱為友善的、有益的或健康的細菌，與人類腸道中發現的有益微生物相似，可以幫助預防和治療某些疾病。含有益生菌的食物、飲料（果汁、大豆飲料）和膳食補充劑（例如膠囊、片劑和散劑）等已被人們廣泛利用[13-14]。隨著對一些乳酸桿菌（例如嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧乳桿菌）研究的深入，乳酸桿菌不僅在發酵食品和膳食補充劑中得以廣泛應用，而且也被用于治療和預防多種疾病和病癥[15-16]，包括預防肥胖和糖尿病的發生[17-18]。以往的研究表明，雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、加氏乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌等益生菌均能發揮降脂緩解肥胖作用[19-21]。同時，不同類型益生菌干預肥胖的研究結果可能會因實驗方法、攝入劑量、持續時間和干預人群等不同而存在差異性[22]。因此，本實驗以C57BL/6J小鼠為研究對象，利用高脂飲食誘導的肥胖模型，探討干酪乳桿菌NCU011054（Lactobacillus caseiNCU011054）以及嗜酸乳桿菌NCU433（Lactobacillus acidophilusNCU433）對高脂飲食誘導肥胖小鼠的干預作用，以期為肥胖人群的飲食策略提供新的思路和參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級6 周齡雄性C57BL/6J小鼠（動物使用許可證號：SYXK（贛）2015-0001）、普通維持飼料購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；45%高脂飼料D12451購自美國Research Diets公司；兩種乳桿菌菌粉（Lactobacillus caseiNCU011054、Lactobacillus acidophilusNCU433）取自南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室。

4 mm研磨珠（氧化鋯）武漢塞維爾生物科技公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）片劑北京索萊寶生物科技有限公司；質量分數4%多聚甲醛固定液（含焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC））、小鼠膽固醇（cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒南京建成生物科技有限公司；小鼠瘦素、脂聯素測定試劑盒上海撫生實業有限公司。

1.2 儀器與設備

AB-104電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；ACCU-CHEK Performa血糖儀、配套血糖試紙 瑞士Roche公司；高速組織研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；BS500型全自動生化分析儀 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；多功能酶標儀美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的制備

將兩種乳桿菌粉末通過平板計數法計算活菌數后，將其稀釋在無菌生理鹽水中至指定劑量（1×109、1×1010CFU/mL）。

1.3.2 動物實驗設計與分組

72 只C57BL/6J小鼠適應1 周后，隨機分為6 組，分別為正常飲食組（ND）、高脂飲食對照組（HFD）、Lactobacillus caseiNCU011054低劑量組（LCL）、Lactobacillus caseiNCU011054高劑量組（LCH）、Lactobacillus acidophilusNCU433低劑量組（LAL）、Lactobacillus acidophilusNCU433高劑量組（LAH）。低劑量組菌粉劑量為1×109CFU/mL，高劑量組菌粉劑量為1×1010CFU/mL。小鼠飼養期間自由采食飲水，每天按10 mL/kgmb給小鼠灌胃菌粉懸浮液，ND和HFD組小鼠則用對應體積的生理鹽水灌胃。9 周后處死小鼠，取樣。

1.3.3 樣品采集和檢測

1.3.3.1 常規指標的測定

每周稱量一次小鼠體質量，計算出實驗期間小鼠體質量增量，小鼠處死后測量小鼠體長（體長為鼻尖至肛門的距離），并記錄數據。解剖小鼠后，取出附睪脂肪、腹腔脂肪、肝臟、腎臟等稱質量，分別按公式（1）、（2）計算Lee’s指數及相應的器官指數。

1.3.3.2 空腹血糖濃度的測定

第9周時，采用血糖儀測定各組小鼠的空腹血糖濃度。

1.3.3.3 血清生化指標水平的測定

灌胃期結束后，眼眶取血，在4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，取上層血清，得到血清樣本。取各組小鼠血清樣本，采用全自動生化儀測定TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，L D L-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，AST）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、肌酐（creatinine，CREA）、尿酸（uric acid，UA）、尿素的水平。

1.3.3.4 血清瘦素和脂聯素質量濃度的測定

灌胃期結束后，眼眶取血，在4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，取上層血清并采用相應試劑盒檢測小鼠血清中瘦素和脂聯素的質量濃度。

1.3.3.5 脂肪組織病理學分析

取小鼠白色脂肪組織約50 mg，置于質量分數4%多聚甲醛固定液中固定24 h以上，常規石蠟包埋和切片，并采用蘇木精-伊紅染色，隨后顯微鏡觀察白色脂肪細胞形態以及細胞分化情況。

1.3.3.6 肝臟甘油三酯和膽固醇含量測定

稱取小鼠肝臟40 mg，加入4 mm研磨珠（氧化鋯），按1∶9（m/V）的比例加入預冷的PBS，高速研磨后3 000 r/min離心15 min，取出上清液，采用試劑盒進行測定。

1.3.3.7 肝臟抗氧化水平測定

將肝臟制成10%的組織勻漿，采用試劑盒依次檢測肝臟組織勻漿中GSH-Px、SOD、CAT活力、MDA水平和T-AOC。

1.3.3.8 糞便短鏈脂肪酸水平測定

取50 mg結腸內容物，置于冰浴，按1∶9（m/V）加入超純水，漩渦振蕩直至混勻，超聲5 min，4 ℃下4 800×g離心20 min，取上清液，沉淀物按1∶7（m/V）加入超純水，漩渦混勻后超聲5 min，4 ℃下4 800×g離心20 min，合并上清液，測定pH值，上清液用于測定短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）。參照Hu Jielun等[23]的方法進行測定。

1.4 數據統計分析

實驗數據采用GraphPad Prism 6.01軟件進行數據分析以及圖像處理，數據以平均值±標準差表示，組間顯著性差異分析采用單因素方差分析法，組間的兩兩比較采用Tukey’s法，P＜0.05定義為存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 兩種乳桿菌對肥胖小鼠表觀肥胖度的影響

圖 1 兩種乳桿菌對肥胖小鼠體質量變化趨勢（A）、體質量增量（B）、附睪脂肪質量（C）和Lee’s指數（D）的影響Fig. 1 Effect of Lactobacillus strains on body mass (A), body mass gain (B),epididymal fat mass (C) and Lee’s index (D) of obese mice

由圖1A可知，與ND組相比，HFD組體質量增長趨勢呈穩步上升趨勢。與HFD組相比，菌粉組的體質量增長速率較慢。由圖1B可知，到實驗周期結束時，ND、LC、LA各劑量組的體質量增量顯著低于HFD組，HFD組的平均體質量增量比ND組高6.645 g（超出20%），這表明本研究中的肥胖模型建模成功。此外，兩菌粉高劑量組的體質量增量比低劑量組小。由圖1C可知，ND、LC、LA組的附睪脂肪質量都顯著低于HFD組，且兩菌粉組還呈現一定的劑量依賴性，由此可見，這兩株乳酸桿菌能較好地抑制由高脂飲食引起的附睪脂肪組織增長作用。Lee’s指數是一項評價動物肥胖程度的指標，其越大表明動物的肥胖程度越高。由圖1D可知，HFD組的Lee’s指數顯著高于ND組和LC、LA組，其中LAH組和ND組的Lee’s指數更接近，表明LAH組更趨于正常。此外，研究表明Lactobacillus paracaseisubsp.paracaseiM5及Lactobacillus coryniformissubsp.torquensT3L能顯著降低小鼠體質量、體脂率及Lee’s指數[24]，這與本研究結果一致。

2.2 兩種乳桿菌對肥胖小鼠空腹血糖和血脂的影響

圖 2 乳桿菌對肥胖小鼠空腹血糖（A）、TC（B）、TG（C）、LDL-C（D）和HDL-C（E）濃度的影響Fig. 2 Effect of Lactobacillus strains on fasting blood glucose (A),TC (B), TG (C), LDL-C (D) and HDL-C (E) in obese mice

長期攝入高脂膳食使機體處于肥胖狀態會引起機體糖脂代謝紊亂，初步表現為機體空腹血糖濃度升高，血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平下降。由圖2A可知，灌胃菌粉9 周后，HFD組小鼠的空腹血糖濃度顯著高于ND組和LC、LA各劑量組，其中LC、LA菌粉組均呈現一定的劑量依賴性，且LAH組的空腹血糖濃度與ND組最接近。此外，HFD組的血清TC、TG、LDL-C水平均顯著高于ND組，而HDL-C水平顯著低于ND組，與此同時，LC、LA兩菌粉組的血清TC、TG、LDL-C濃度均顯著低于HFD組，HDL-C水平顯著高于HFD組（圖2B～E）；整體結果顯示菌粉組對肥胖小鼠的空腹血糖濃度和血脂有很好的干預作用，且菌粉LCH和LAH組能將血清TG和LDL-C降至和ND組相近水平。LAH組的空腹血糖濃度以及血清TG和LDL-C水平與ND組接近，且LAH組能改善小鼠血清TC和HDL-C水平。由此可知，菌粉組的效果呈現一定劑量依賴性，兩株菌粉對肥胖小鼠的空腹血糖濃度和血脂水平都有一定的調節作用，Zhao Xin等[25]的研究結果顯示植物乳桿菌CQPC02能夠降低肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，這與本研究結果一致。

2.3 乳桿菌對肥胖小鼠肝臟和腎臟功能的影響

表 1 乳桿菌對肥胖小鼠肝臟指數及肝功能指標的影響Table 1 Effect of Lactobacillus strains on liver index and liver function in obese mice

表 2 乳桿菌對肥胖小鼠腎臟指數及腎功能指標的影響Table 2 Effect of Lactobacillus strains on kidney index and kidney function in obese mice

器官指數能在一定程度上反映動物的健康狀態。高脂膳食誘導的肥胖十分嚴重時也會造成機體臟器功能發生紊亂。由表1、2可知，兩菌粉組的肝臟指數與ND組接近，其中LA組與ND組更接近，但均與HFD組無顯著性差異。ND、LAH組的腎臟指數與HFD組相比有顯著差異（P＜0.05）。LCL、LCH、LAL組雖然與HFD組沒有顯著差異，但趨于正常。LC、LA兩菌粉組血清中肝功能相關的ALT、AST、TP、ALB指標以及腎功能相關的CREA、UA、尿素各項指標水平介于ND組和HFD組之間，且各組之間無顯著性差異，這可能是本實驗肥胖周期不夠長而導致的各組之間肝功能和腎功能沒有顯著差異。

2.4 乳桿菌對肥胖小鼠血清瘦素和脂聯素含量的影響

肥胖的發生常常和瘦素、脂聯素水平的波動密切相關。研究者發現，肥胖往往會伴有高瘦素血癥，而肥胖者體內的脂聯素脂肪因子會出現下調[26]。由圖3A可知，兩菌粉組小鼠的血清瘦素水平和ND組十分接近，都低于HFD組，且均與HFD組有顯著性差異，其中LC組小鼠血清瘦素質量濃度低于LA組。由圖3B可知，ND組和兩菌粉組的小鼠血清脂聯素質量濃度都顯著高于HFD組，且LA組小鼠血清瘦素水平高于LC組，ND、LA、LC組與HFD組相比均呈現顯著性差異，其中LC組呈現了一定的劑量依賴性。有研究結果表明，Lactobacillus rhamnosusLS-8和Lactobacillus crustorumMN047能夠抑制由高脂膳食導致的血清瘦素水平的增加和脂聯素水平的下降[27]，與本研究結果類似。以上結果提示，這兩株乳酸桿菌能有效地改善小鼠由肥胖引起的血清瘦素水平升高并控制脂聯素分泌水平，從而起到較好的抗肥胖作用。

圖 3 乳桿菌對肥胖小鼠血清瘦素（A）、脂聯素（B）質量濃度的影響Fig. 3 Effect of Lactobacillus strains on serum leptin (A) and adiponectin (B) levels in obese mice

2.5 脂肪組織病理切片觀察結果

有研究表明一些乳酸菌Lactobacillus plantarum9-41-A、Lactobacillus fermentumM1-16、Lactobacillus reuteri能夠減小肥胖小鼠白色脂肪組織的細胞大小和減少細胞數量[28-29]。同時，本實驗進行了脂肪組織病理切片觀察，以探究Lactobacillus caseiNCU011054和Lactobacillus acidophilusNCU433是否也有抑制肥胖小鼠白色脂肪組織細胞大小和減少細胞數量的作用。

由圖4可知，ND組的脂肪細胞形態完整、排列整齊緊密、整體細胞大小相當，細胞邊界清晰，而HFD組脂肪細胞形態不完整，大小不均勻，絕大部分細胞體積變大，排列也不規則，出現嚴重的分化現象。兩菌粉組的脂肪細胞較HFD組相比，脂肪細胞排列整齊、尺寸均一，少數細胞出現體積變大充脂分化現象，且菌粉組與ND組細胞病理形態更接近。其中，LC組的低劑量和LA組高劑量的脂肪細胞排列整齊，少數細胞體積偏大，出現充脂分化的現象，整體細胞與ND組細胞大小相似，甚至同視野下細胞數目比ND組更少。以上結果表明，這兩株乳酸桿菌還可通過減輕脂肪的積累來抑制肥胖的發展，這與前面抑制小鼠體質量增量和附睪脂肪質量增加的結果一致；因此，兩株乳酸桿菌對體質量增加的抑制作用可能與減少脂肪積累量有關。

圖 4 不同組脂肪組織HE染色圖（400×）Fig. 4 Histological sections of adipose tissues in different groups at (400 ×)

2.6 乳桿菌對肥胖小鼠肝臟質量、膽固醇和甘油三酯含量的影響

圖 5 乳桿菌對肥胖小鼠肝臟質量（A）、肝臟TC（B）和TG（C）含量的影響Fig. 5 Effect of Lactobacillus strains on liver mass (A), and TC (B) and TG (C) contents in liver of obese mice

肥胖的發生往往伴隨著肝臟功能異常，如肝臟腫大以及肝臟脂質代謝紊亂等。長期的高脂膳食會導致肝臟中脂肪酸水平異常，進而導致TC、TG含量升高，嚴重時會導致脂肪肝[30]。由圖5A可知，ND組和兩菌粉組的肝臟質量都低于HFD組，但LCL組與HFD組之間無顯著性差異，其他各組與HFD組相比均有顯著性差異，因此乳桿菌能緩解肥胖小鼠的肝臟腫大現象，LA組比LC組的效果更好。由圖5B、C可知，兩株乳桿菌對調節肝臟的脂質代謝都有一定的緩解作用，如圖5B所示，與HFD相比，LCL和LCH組的TC含量雖然較低但是沒產生顯著性差異，ND、LAL和LAH組都顯著低于HFD組。如圖5C所示，ND組和兩菌粉組的TG含量都低于HFD組，且與HFD組都有顯著性差異，其中，LA組與ND組更接近，降TG的效果優于LC組。結果表明，這兩株菌粉能夠降低由肥胖引起肝臟中脂質的堆積，對肝臟的脂代謝有一定調節作用。此外，也有研究表明，Lactobacillus plantarumKY1032和Lactobacillus curvatusHY7601能夠改善肝臟脂質代謝和抑制由高脂飲食誘導的小鼠肥胖[31]，這與本研究結果一致。

2.7 乳桿菌對肥胖小鼠肝臟抗氧化能力的影響

長期高脂膳食會導致機體產生過多的自由基，造成機體氧化損傷。GSH-Px、T-SOD、CAT等抗氧化酶可以協同清除機體產生的過多活性氧自由基。另外，MDA是機體多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產物，機體MDA含量越高，表明機體損傷越嚴重，而T-AOC反映了機體抗氧化能力的總水平[32]。

表 3 乳桿菌對肥胖小鼠肝臟抗氧化水平的影響Table 3 Effect of Lactobacillus strains on oxidative stress in liver ofobese mice

由表3可知，HFD組小鼠的GSH-Px活力低于其余各組，且LCL組極顯著高于HFD組（P＜0.01），LC兩劑量組的GSH-Px活力均高于LA組的兩個劑量組；此外，各組小鼠肝臟的T-SOD活力、T-AOC與HFD組相比均無顯著性差異，但HFD組的T-SOD活力、T-AOC均低于ND組和兩菌粉組；各組小鼠肝臟CAT活力均高于HFD組，但沒有顯著性差異，LCL組小鼠肝臟中的CAT活力極顯著高于HFD組（P＜0.01），LC組的CAT活力高于LA組；ND、LAL、LAH組的小鼠肝臟中MDA水平極顯著低于HFD組（P＜0.01），其他各組也低于HFD組，但沒有顯著性差異，LA組低于LC組。以上結果表明，這兩株乳酸桿菌能提高肥胖小鼠肝臟內抗氧化酶活力，降低具有細胞毒性的MDA含量，提高肥胖小鼠總抗氧化的水平。綜合以上結果，LC和LA菌株有良好的抗氧化效果，可以抑制由肥胖引起的肝臟氧化損傷。有研究表明Lactobacillus paracaseisubsp. paracaseiM5和Lactobacillus coryniformissubsp. torquensT3有很好的抗氧化效果，可以較好地抑制高脂膳食誘導的肥胖引起的肝臟損傷[26]，這與本實驗結果一致。

2.8 乳桿菌對肥胖小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響

圖 6 乳桿菌對肥胖小鼠糞便SCFAs的影響Fig. 6 Effect of Lactobacillus strains on short-chain fatty acids in feces of obese mice

研究表明，遺傳性肥胖的嚙齒類動物和超重成年人的糞便SCFAs含量比同類正常體質量的糞便SCFAs含量高[33-34]。然而，也有研究報道，在飲食誘導的肥胖小鼠中，其糞便中的SCFAs（乙酸和丙酸）含量降低[35]。在本研究中，HFD組小鼠糞便中乙酸、丁酸、戊酸含量顯著低于ND組，丙酸含量低于ND組。由圖6可知，ND組和LCH、LAL、LAH組肥胖小鼠糞便中乙酸含量與HFD組相比有顯著性差異（P＜0.05），但是ND組高于HFD組，菌粉組都低于HFD組；此外，LCH、LAL、LAH組肥胖小鼠糞便中的丙酸含量與HFD組有顯著性差異（P＜0.05），且菌粉組都低于HFD組；另外，丁酸、戊酸、異戊酸的分析結果顯示，菌粉組與HFD組相比均沒有顯著性差異，但LCH、LAL、LAH組肥胖小鼠糞便中的異丁酸水平卻顯著低于HFD組（P＜0.05）。本研究中，灌胃兩株乳桿菌組的小鼠糞便SCFAs含量均低于HFD組，這可能是由于灌胃乳酸桿菌株引起腸道環境中其他代謝產物的代償性變化。

3 討 論

本實驗在建立高脂飲食誘導肥胖模型的基礎上，探討了Lactobacillus caseiNCU011054、Lactobacillus acidophilusNCU433對肥胖小鼠的調節作用。結果表明，兩株乳桿菌有效抑制了小鼠肥胖癥狀及小鼠血糖血脂的升高程度，與已有的研究報道的結果[36-37]一致。同時，乳桿菌能顯著降低小鼠血清瘦素水平，升高血清脂聯素的水平，這與宋晨[26]的研究結果相同。脂肪組織切片結果提示菌乳桿菌能有效抑制肥胖小鼠的脂肪累積及脂肪細胞分化，與已報道的研究結果[38]一致。此外，乳桿菌有效降低了小鼠肝臟質量，改善了小鼠肝臟腫大的癥狀，明顯降低了肥胖小鼠肝臟中TC、TG的含量，較好調控了肝臟中脂質積累和代謝，這與Wang Jingjing等[39]的研究結果相一致。本實驗還發現乳桿菌降低了乙酸、丙酸和丁酸的水平，這可能是由于乳桿菌間接提高了腸道里面其他代謝物的水平[14]。綜上所述，兩種乳桿菌L a c t o b a c i l l u s c a s e iNCU011054和Lactobacillus acidophilusNCU433能有效調控肥胖引起的血糖血脂代謝紊亂、調節血清瘦素和脂聯素水平、改善肝臟腫大癥狀和肝臟TC和TG的堆積、抑制肥胖小鼠脂肪細胞增大和分化、降低脂肪累積和體質量增量，對肥胖小鼠起到較好的干預作用，這將為這兩種乳桿菌未來應用于肥胖的飲食干預提供參考和基礎數據。