SIRT3多酚激活劑的篩選及其對UVB誘導HaCaT細胞衰老的修復作用

陳 慧，YOSHINORI Katakura，扈洪波，尹淑濤，趙 沖,

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2.九州大學農學院生物科學與生物技術系，日本 福岡 8128581）

在哺乳動物中，Sirtuins家族中有7 個成員，沉默信息調節(jié)因子2相關酶類（silent mating type information regulation 2 homolog，SIRT）1～7，它們分別定位于細胞的不同位置，而SIRT3是唯一定位于線粒體的去乙酰化酶，它可以通過控制蛋白的乙酰化/去乙酰化水平調節(jié)線粒體中酶的活性，影響線粒體功能及細胞生理狀態(tài)[1]。SIRT3不僅影響能量代謝過程，包括三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、脂肪酸氧化及酮體的生成，還參與維持線粒體的氧化還原穩(wěn)態(tài)[2]。線粒體內電子傳遞過程中因電子泄漏產生的活性氧可損傷線粒體內外的大分子及細胞膜結構，是目前公認的與衰老相關的病理機制之一[3]。事實上，實驗和基因遺傳研究證據都表明SIRT3活性與延緩衰老有關。關于意大利南部人群的研究表明，蘇格蘭人SIRT3基因的單核苷酸多態(tài)性（G477T）3號位點外顯子和數(shù)目可變串聯(lián)重復序列（variable number of tandem repeats，VNTR）5號位點內含子序列與壽命延長有關[4-5]。VNTR具有增強子特性，能夠決定SIRT3基因的轉錄活性，而缺乏VNTR增強子活性的老人壽命明顯較短。因此，SIRT3在延緩衰老中具有重要的作用，增強SIRT3的轉錄活性有利于延緩衰老的發(fā)生。

多酚類化合物是一類具有良好抗氧化活性的次生代謝產物，廣泛存在于各種可食用植物中，如葡萄、石榴、茶葉、咖啡豆等。綠茶多酚通過上調SIRT3蛋白表達水平，降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）2的乙酰化水平，從而增強SOD2的抗氧化活性，有效緩解高脂飲食誘導的氧化應激造成的腎臟組織損傷[6]。此外，綠茶多酚可降低正常大鼠腎皮質4-羥基壬烯酸水平，其可能的機制與上調腎皮質SIRT3的表達有關[7]。石榴皮多酚Pomegraniin A可減少細胞內活性氧的生成，依賴于SIRT3介導的去乙酰化作用而增強SOD2的抗氧化活性[8]。所以，多酚類化合物是篩選SIRT3激活劑的重要來源之一。根據結構特點，本實驗選取了常見的食物原料葡萄、茶葉、石榴、青稞中的7 種代表性多酚類化合物，包括白藜蘆醇、山柰酚、石榴皮鞣素、安石榴苷、矢車菊素、飛燕草素葡萄糖苷、漆樹黃酮，以及咖啡豆中的咖啡醇作為篩選SIRT3激活劑的候選化合物（表1）。

表 1 具有SIRT3潛在激活作用的多酚類化合物Table 1 Polyphenols with potential effect on SIRT3 activation

前期研究表明，這8 種化合物在人結腸癌細胞Caco2中對SIRT3的轉錄激活作用有不同的影響[8]，本實驗將進一步探究這8 種化合物對于人正常皮膚永生化角質形成細胞（human immortalized keratinocytes，HaCaT）中的SIRT3轉錄活性的影響，并且以中波紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）誘導的HaCaT細胞衰老模型，探究SIRT3多酚激活劑是否可以通過SIRT3介導的抗氧化應激途徑減少UVB誘導的HaCaT細胞氧化應激損傷，從而修復細胞衰老。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HaCaT購于日本理研生物資源中心。

白藜蘆醇、山柰酚、石榴皮鞣素、安石榴苷、漆樹黃酮、咖啡醇、矢車菊素、飛燕草素葡萄糖苷美國Sigma公司。

DMEM培養(yǎng)基日本Nissui公司；0.25%（質量分數(shù)）胰蛋白酶消化液、胎牛血清美國Life Technologies公司；總R N A 提取試劑盒 瑞士Roche 公司；pEGFP-C3載體日本Takara公司；BES-H2O2-Ac過氧化氫熒光探針日本WAKO公司；SOD2測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）測定試劑盒、SA-β-gal活性檢測試劑盒日本Dojindo公司。

1.2 儀器與設備

CO2培養(yǎng)箱美國Thermo公司；Thermal Cycler Dice Real Time System TP-800聚合酶鏈式反應（polymerase hainreaction，PCR）儀日本Takara 公司；IN Cell Analyzer 1000全自動活細胞圖像分析系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；CL-1000紫外交聯(lián)儀美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 構建SIRT3-EGFP報告基因系統(tǒng)

SIRT3-EGFP報告基因系統(tǒng)按照先前建立的方法[8]進行構建。以人類基因組DNA為模板進行PCR擴增人類SIRT3啟動子(-653—-1)，將其裝入無啟動子的pEGFP-C3表達載體中，得到特定的pSIRT3p-EGFP質粒。利用構建的pSIRT3p-EGFP質粒轉染HaCaT細胞，用于評價人類SIRT3啟動子的活性。利用IN Cell Analyzer 1000全自動活細胞圖像分析系統(tǒng)監(jiān)測EGFP熒光強度的變化，可定量測定SIRT3啟動子的活性。

1.3.2SIRT3基因表達水平的測定

細胞內RNA的提取按照總RNA提取試劑盒說明書進行操作。cDNA的合成參照Fujiki等[9]的方法。利用半定量實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）法監(jiān)測細胞SIRT3基因的mRNA表達水平。以β-actin為內參基因。SIRT3和β-actin基因的PCR引物序列分別為：SIRT3前引物序列為5’-CTGTACAGCAACCTCCAGCA-3’，后引物序列為5’-CTCCTTGGCCAAAGTGAAAA-3’；β-actin前引物序列為5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，后引物序列為5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。實驗重復3 次。

1.3.3 細胞培養(yǎng)及細胞衰老模型的建立

采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HaCaT細胞。將處于對數(shù)生長期的細胞接種于細胞培養(yǎng)板上進行實驗。當細胞培養(yǎng)至剛開始出現(xiàn)融合生長時進行UVB照射。吸出培養(yǎng)基，加入少量磷酸緩沖鹽溶液覆蓋細胞，利用紫外交聯(lián)儀對細胞進行紫外線處理，照射劑量為10 mJ/cm2，共照射2 次，每隔24 h照射1 次。

1.3.4 細胞內活性氧相對含量的測定

細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量采用過氧化氫特異性熒光探針BES-H2O2-Ac法測定。吸出培養(yǎng)基，用pH 7.4的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）緩沖液洗滌細胞2 次，然后加入終濃度為5 μmol/L的 BES-H2O2-Ac和Hoechst 33342染料，37 ℃培養(yǎng)箱內孵育30 min。消化并收集細胞，HEPES潤洗2 次后采用IN Cell Analyzer 1000全自動活細胞圖像分析系統(tǒng)進行檢測。

1.3.5 細胞抗氧化活性的測定

通過測定細胞SOD2相對活力及GSH/GSSG比值評價細胞的抗氧化活性。按照相應試劑盒說明書的操作進行測定。

1.3.6 細胞內SA-β-gal相對活力的測定

采用SA-β-gal相對活力檢測試劑盒，按照說明書的操作進行，采用IN Cell Analyzer 1000全自動活細胞圖像分析系統(tǒng)進行檢測。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0數(shù)據處理軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析進行組間比較，Tukey法進行事后檢驗，結果以平均值±標準差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 多酚類化合物對HaCaT SIRT3轉錄活性的影響

圖 1 SIRT3多酚激活劑篩選系統(tǒng)Fig. 1 Screening system for SIRT3 activators from polyphenols

通過建立HaCaTSIRT3-EGFP報告基因系統(tǒng)（圖1），本實驗共評價了8 種化合物對SIRT3轉錄活性的影響。這些化合物包括白藜蘆醇、山柰酚、石榴皮鞣素、安石榴苷、漆樹黃酮、咖啡醇、矢車菊素、飛燕草素葡萄糖苷。依據前期的研究結果[10]，安石榴苷等幾種多酚化合物在10 μmol/L時顯著修復了UVB對HaCaT細胞活力的損傷，因此本實驗中的所有細胞實驗也均采用了此濃度。通過對EGEP進行熒光定量分析（圖2），結果表明，與二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）組（對照組）相比，白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮和咖啡醇顯著增強了EGFP熒光強度。石榴皮鞣素、矢車菊素和飛燕草素葡萄糖苷對SIRT3的轉錄活性影響不顯著。

圖 2 多酚類化合物對EGFP相對熒光強度的影響Fig. 2 Effect of polyphenols on relative fluorescence intensity of EGFP

本研究進一步利用qPCR技術，檢測了白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮和咖啡醇對HaCaT內源性SIRT3基因表達水平的影響（圖3），發(fā)現(xiàn)SIRT3基因表達水平均有顯著上調，與它們增強EGFP水平的結果具有一致性。因此，白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮和咖啡醇能上調HaCaT中SIRT3基因的表達。

圖 3 多酚類化合物對SIRT3 mRNA表達水平的影響Fig. 3 Effect of polyphenols on SIRT3 mRNA expression

2.2 SIRT3多酚激活劑對UVB誘導的細胞內ROS相對含量的影響

圖 4 SIRT3多酚激活劑對UVB誘導的細胞內ROS相對含量的影響Fig. 4 Effect of SIRT3-activating polyphenols on intracellular ROSlevels induced by UVB exposure

紫外線照射是皮膚損傷的重要因素之一。UVB是波長在280～320 nm的中波紫外線，它可以穿透表皮層進入真皮層，從而引起DNA的損傷或是ROS的產生，引發(fā)基因突變及衰老的發(fā)生[11]。為了確定合適的誘導細胞發(fā)生衰老的UVB照射劑量，實驗中設置4 個照射劑量組，分別為0、6、8、10 mJ/cm2。

圖4A結果顯示，UVB照射劑量為10 mJ/cm2時，與空白組相比，細胞內ROS相對含量顯著增加（P＜0.05），6、8 mJ/cm2的UVB照射劑量對細胞內ROS相對含量沒有顯著影響。因此，UVB照射劑量為10 mJ/cm2可作為誘導細胞衰老以及篩選抗自由基多酚化合物的最佳劑量。HaCaT在10 mJ/cm2的UVB照射劑量處理之后，SIRT3多酚激活劑白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮及咖啡醇均以10 μmol/L的濃度干預48 h，按照1.3.4節(jié)中的方法測定細胞內ROS相對含量，結果如圖4C所示。為了排除化合物自身對細胞內ROS的影響，同時也檢測了無UVB照射且其他條件相同的情況下細胞內ROS相對含量（圖4B）。結果顯示，當無UVB照射時，相比于DMSO組，白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮及咖啡醇處理之后，細胞內ROS相對含量沒有顯著變化，表明這些化合物不會改變正常細胞內ROS的水平。當照射劑量為10 mJ/cm2時，白藜蘆醇、安石榴苷、漆樹黃酮及咖啡醇均顯著降低了UVB誘導細胞產生的ROS相對含量，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），山柰酚處理組與對照組中細胞內ROS相對含量無顯著差異。總而言之，除山柰酚外，其他SIRT3多酚激活劑均能降低UVB誘導的細胞氧化應激水平。

2.3 SIRT3多酚激活劑對UVB誘導的細胞SA-β-gal活性的影響

SA-β-gal是一種溶酶體水解酶，其最佳酶活性是在pH 4.0的條件下，而衰老細胞在pH 6.0的條件下此酶活性會顯著增強，因此SA-β-gal活性是作為評價細胞衰老水平的關鍵指標[12]。通過測定細胞SA-β-gal活性，可進一步驗證10 mJ/cm2的UVB照射劑量是否成功誘導細胞衰老模型的形成。

圖 5 UVB照射誘導的細胞衰老Fig. 5 Cellular senescence induced by UVB irradiation

如圖5所示，細胞從左往右分布，表明細胞體積逐漸增大。與未經UVB照射處理的細胞相比，10 mJ/cm2照射劑量處理下的細胞體積變大，SA-β-gal染色陽性細胞明顯增多，即處于衰老狀態(tài)的細胞數(shù)量增多。所以10 mJ/cm2照射劑量的UVB處理可以誘導細胞衰老的發(fā)生。本研究分別評價了前期篩選得到的SIRT3多酚激活劑白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮及咖啡醇對細胞衰老的影響，測定它們對UVB處理之后HaCaT SA-β-gal活性的影響。

圖 6 激活SIRT3的多酚類化合物對UVB誘導的細胞SA-β-gal活性的影響Fig. 6 Effect of SIRT3-activating polyphenols on intracellular SA-β-gal activity induced by UVB

圖6表明，在這5 種化合物中，安石榴苷顯著降低了細胞SA-β-gal活力（P＜0.05），而其他4 種化合物對細胞SA-β-gal活力均沒有顯著影響。以上研究結果表明，安石榴苷能有效抑制UVB誘導的皮膚細胞衰老。

2.4 SIRT3多酚激活劑對細胞SOD2相對活力和GSH/GSSG比值的影響

圖 7 激活SIRT3的多酚類化合物對UVB誘導的細胞SOD2活性的影響Fig. 7 Effect of SIRT3-activating polyphenols on intracellular SOD2 activity induced by UVB

SOD與GSH是內源性抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶及抗氧化物質。SOD2是細胞線粒體內一種重要的抗氧化蛋白，通過催化超氧陰離子形成細胞毒性較弱的H2O2，H2O2進一步分解，從而降低活性氧對細胞的損傷作用。研究表明SIRT3的激活有助于增強SOD2的活性，從而降低細胞內ROS水平，維持細胞氧化還原平衡[13]。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，將H2O2轉化成對細胞無毒性作用的H2O，而GSH自身則被氧化成GSSG[14]。因此，GSH/GSSG比值可以反映細胞的氧化應激水平。GSH/GSSG比值也同樣受到SIRT3的調控，SIRT3通過直接去乙酰化作用，增強線粒體異檸檬酸脫氫酶2活性，提高線粒體內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）水平，而NADPH可介導谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的活性來維持氧化還原平衡[15-16]。

由圖7可知，白藜蘆醇與咖啡醇處理組細胞的SOD2活力顯著增強，而其他多酚類化合物對SOD2活力沒有顯著性影響。

圖 8 激活SIRT3的多酚類化合物對UVB誘導的細胞GSH/GSSG比值的影響Fig. 8 Effect of SIRT3-activating polyphenols on intracellularGSH/GSSG ratio induced by UVB

圖8中激活SIRT3的多酚類化合物均提高了細胞GSH/GSSG比值，且與DMSO組相比有顯著性差異，其中安石榴苷與山柰酚的作用效果最佳，GSH/GSSG比值均提高了4 倍以上。

3 討 論

衰老是生命有機體的自然規(guī)律和必然結果，而皮膚作為人體抵御外界環(huán)境的最外層屏障，容易受到外界因素的直接干擾，如長期紫外線的照射則會促進皮膚老化[17]。紫外線誘導皮膚發(fā)生老化的原因之一是過量ROS的產生，而線粒體是ROS產生的主要部位[18-20]。SIRT3屬于哺乳動物SIR2同源基因，定位于線粒體并調節(jié)線粒體功能，包括代謝、能量穩(wěn)態(tài)和調節(jié)氧化應激反應[13]。多項研究表明SIRT3介導的線粒體內ROS穩(wěn)態(tài)的調節(jié)有助于緩解衰老以及過度氧化應激造成的組織損傷[21-23]。SIRT3作為抗氧化調節(jié)信號通路的上游靶點，激活SIRT3的活性物質則具有潛在的抗衰老作用。

實驗結果顯示，8 種多酚化合物中白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮和咖啡醇可顯著上調SIRT3基因表達水平（圖2、3），并進一步評價了這5 種SIRT3多酚激活劑對UVB引起細胞產生過量ROS的清除作用。顯然，除了山柰酚之外，對SIRT3有激活作用的化合物均顯著減少了UVB誘導的細胞內ROS水平（圖4C）。Vitale等[24]研究發(fā)現(xiàn)在UVB處理HaCaT之前，經過白藜蘆醇預處理的HaCaT內產生的ROS減少。白藜蘆醇不僅可以防止UVB照射引起的皮膚氧化損傷，而且對損傷后的皮膚還具有修復作用。安石榴苷、漆樹黃酮和咖啡醇在多種細胞模型和體內動物實驗中均表現(xiàn)有抗氧化活性[25-28]，本實驗中它們均顯著降低了UVB處理后HaCaT內ROS水平。由此可見，白藜蘆醇、安石榴苷、漆樹黃酮和咖啡醇是極具潛力的抗氧化活性物質。此外，在10 mJ/cm2UVB照射劑量下，HaCaT氧化應激水平增加，細胞發(fā)生衰老（圖5）。在白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮、咖啡醇的干預下，安石榴苷處理組細胞的SA-β-gal活性顯著下降，表明安石榴苷能促進UVB所誘導細胞衰老的修復。激活SIRT3的多酚類化合物對細胞抗氧化系統(tǒng)的修復具有不同程度的影響（圖7、8），表明這些多酚類化合物除了依賴于SIRT3-SOD2途徑增強細胞抗氧化活性外，可能還存在其他的機制，如直接清除自由基、作為氧化還原酶底物以及其他氧化調節(jié)信號通路如Nrf2/Keap1-ARE、MAPK及PI3K/Akt等[29-31]。自由基的過量產生是導致細胞衰老的因素之一，安石榴苷的抗衰老作用離不開其抗氧化作用，但也可能存在其他的抗衰老機制，如SIRT1介導的核苷酸切除修復途徑[10]，其他SIRT3多酚激活劑在增強細胞抗氧化系統(tǒng)活性的同時并沒有改善細胞的衰老現(xiàn)象。此外，楊明美等[32]的研究表明安石榴苷對UVB誘導的HaCaT損傷具有預保護作用，主要是通過抑制UVB誘導的MAPK亞族中ERK、JNK和p38的活化，從而減少細胞凋亡。安石榴苷不僅可以緩解UVB照射引起的皮膚受損，而且對皮膚的損傷及老化具有一定的修復作用。

綜上所述，通過SIRT3-EGFP報告基因系統(tǒng)篩選得到5 種多酚類化合物具有增強SIRT3基因表達的作用，分別是白藜蘆醇、山柰酚、安石榴苷、漆樹黃酮和咖啡醇；白藜蘆醇、安石榴苷、漆樹黃酮以及咖啡醇均能有效降低UVB誘導的細胞內ROS水平；這5 種多酚均顯著提高了GSH/GSSG比值，白藜蘆醇與咖啡醇顯著增強了SOD2活性；安石榴苷不僅可以激活SIRT3，修復細胞的抗氧化系統(tǒng)，緩解UVB誘導的HaCaT衰老，其抗衰老機制可能與SIRT3-NADPH-GSH/GSSG抗氧化途徑有關。本研究更加確證了安石榴苷在抗衰老方面的作用并初步探究了其機制，今后將進一步從動物體內水平評價安石榴苷在抗衰老方面的效果，并從分子水平深入闡明其作用機制，為安石榴苷在功能食品、護膚產品等方面的應用提供充分的理論依據。