均質工藝對制備魚油微膠囊結構和理化性質的影響

周麟依，任雙鶴，郭亞男，樊乃境，江連洲,2,3，賈富國，王中江,5,6,，劉 軍

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.山東萬得福實業集團有限公司，山東 德州 253000；3.臨邑禹王植物蛋白有限公司，山東 德州 253000；4.東北農業大學工程學院，黑龍江 哈爾濱 150030；5.克東禹王大豆蛋白食品有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 230200；6.黑龍江國如生物科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150030）

深海魚油是從深海魚類動物體中提煉出來的不飽和脂肪成分，其中富含的兩種ω-3多不飽和脂肪酸——二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是人體重要的不飽和脂肪酸來源。研究發現，魚油具有多種生物活性功能，如降血脂、清除自由基、疏通血管、補腦健腦、調節免疫系統、預防心血管疾病等，使其在功能性食品行業擁有較大的開發前景[1]。然而，魚油脂肪酸的高度不飽和性導致魚油極其容易在光和熱的作用下發生氧化，喪失其原有的生物活性和營養價值，限制了魚油在食品工業中的發展[2]。因此，利用壁材對魚油進行包埋，提高魚油制品的感官品質和穩定性，對魚油制品在食品工業中的應用具有重要意義。目前，根據芯材和壁材的性質及微膠囊的粒徑、釋放特性以及靶向性的要求，可選擇不同的微膠囊化方法，具體分為物理化學法、物理機械法、化學法3 類。而考慮到魚油微膠囊的芯材理化特性、操作便捷性和食品安全性，工廠常采用物理機械法進行制備。因此，物理機械法對魚油納米乳液的影響直接決定著魚油微膠囊的產品品質。

目前，魚油納米乳液的加工方法主要有高壓均質、空化射流和超聲破碎3 種。綦玉曼等[3]研究了高壓均質壓力對薄荷油納米乳液理化性質的影響，結果發現高壓均質壓力為80 MPa時薄荷油納米乳液理化性質最為穩定。江連洲等[4]研究了大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液超聲制備工藝，確定了大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液均質工藝的最佳工藝參數為超聲功率500 W、超聲時間9 min。Akbas等[5]比較了高壓均質和超聲破碎兩種均質工藝制備的辣椒油納米乳液，結果發現高壓均質相較于超聲破碎有更高的包埋能力。李楊等[6]研究了不同蛋白種類及微射流處理壓力對魚油微膠囊品質的影響，結果發現在合適處理壓力下制備的魚油微膠囊的包埋率、氧化穩定性和熱穩定性均較好。江連洲等[7]研究了空化射流處理工藝對魚油微膠囊的理化性質影響，結果發現在合適的工藝條件下得到的魚油微膠囊微觀結構呈球形顆粒，結構致密、顆粒形態完整、粒徑小、表面含油率較低、包埋效果好。劉曉麗等[8]探討了超聲工藝對魚油微膠囊及其貯藏穩定性和生物利用度的影響，結果表明超聲輔助可以顯著提高產品的理化指標和降脂活性。鄭景霞等[9]探究了高壓均質工藝對魚油納米乳液及其貯藏穩定性的影響，結果表明經處理后魚油氧化穩定性和儲藏穩定性顯著提高。因此，均質工藝對納米乳液的理化性質及后續微膠囊加工具有極大的影響[10-11]。但目前研究大多停留于一種均質工藝對油脂納米乳液或微膠囊理化性質的影響上。空化射流技術的原理是在空化腔內使溶劑分子受到空化作用、高速剪切及劇烈振動，促使產生空泡，這些空泡迅速脹大后瞬時閉合，產生劇烈沖擊波，導致液體微粒間發生強烈的撞擊作用，使大分子聚合物降解，致密結構被打開，從而有效發揮物料功能性質[12-13]。因此，該技術是一種集物料空化、均質、粉碎等操作于一體的新興物理場技術。目前的研究大多停留在高壓均質和超聲破碎兩種均質工藝對油脂納米乳液理化性質的影響上[14]，對新型均質技術空化射流的研究較少，且鮮有將均質工藝作為影響微膠囊結構和理化性質因素的研究。

因此，本實驗以易氧化、穩定性較差的深海魚油作為芯材，根據前期實驗結果選擇大豆分離蛋白和磷脂酰膽堿作為壁材，經空化射流、高壓均質和超聲破碎3 種不同均質方式制備納米乳液，通過噴霧干燥的干燥工藝制備微膠囊，從結構和理化性質兩方面分析不同的均質工藝對魚油納米乳液及微膠囊的影響，從而為魚油深度加工時均質工藝的選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白質量分數92.6%）、魚油（含8.55% EPA、15.89% DHA）來源于深海沙丁魚，購自山東禹王生態食業有限公司。

磷脂酰膽堿北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉天津市東麗區天大化學試劑廠；常規分析純級試劑北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

Ultra-Turrax T25高速分散器 德國IKA公司；JY92-IIN型超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；KL-80空化射流均質機北京中森匯嘉科技發展有限責任公司；JSM-6390LV掃描電子顯微鏡日本JEOL公司；JOYN-8000噴霧干燥機上海橋躍電子有限公司；BSA124S電子分析天平（0.000 1 g）北京賽多利斯儀器系統有限公司；TG16-WS臺式高速離心機湖南湘儀離心機儀器有限公司；HSS-1（B）型恒溫浴槽成都儀器廠；Zetasizer Nano-ZS 90光散射粒度分析儀英國馬爾文儀器有限公司；SGW-2傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀、PHS-3C雷磁pH計上海精密科學儀器有限公司；209F3熱重分析儀 耐馳（上海）機械儀器有限公司；實驗型高壓均質機 英國Stansted Fluid Power公司；Turbiscan Lab分散穩定性分析儀 法國Formulaction公司；NDJ-8S型黏度計上海大平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 粗乳液的制備

將4%（終質量分數，下同）大豆分離蛋白分散于0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液中，室溫下連續攪拌120 min，作為水相；將0.8%魚油和0.2%磷脂酰膽堿混合均勻，作為油相；在高速分散器的攪拌下把油相逐滴加入水相中，2 900×g均質5 min得到粗乳液。

1.3.2 魚油納米乳液和微膠囊的制備

將粗乳液分別通過高壓均質機、空化射流均質機和超聲波細胞破碎機進一步均質乳化即得不同均質工藝制備的魚油納米乳液。分別以均質壓力、空化射流時間、超聲功率為考察因素進行單因素試驗，測定魚油納米乳液在不同均質條件下的平均粒徑、Zeta-電位、黏度、穩定性。高壓均質工藝采用的均質壓力分別為60、100、140 MPa，均質4 次；空化射流工藝采用的空化射流時間分別為5、10、15 min，空化射流壓力80 MPa；超聲工藝采用的超聲功率分別為250、400、550 W，超聲時間9 min，超聲溫度20 ℃。將經過不同均質工藝處理的納米乳液進行噴霧干燥，進風和出風溫度分別為160 ℃和70 ℃，流速為600 mL/h的條件下制備魚油微膠囊顆粒。

1.3.3 魚油納米乳液理化穩定性的測定

1.3.3.1 平均粒徑、Zeta-電位測定

采用光散射粒度分析儀分別測定魚油納米乳液的平均粒徑和Zeta-電位，魚油油滴的折射率設置為1.45，水相溶液折射率設置為1.33。為了降低多重光散射效應，分析前用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L）稀釋魚油乳液100 倍后測定平均粒徑，稀釋50 倍后測定Zeta-電位[3]。

1.3.3.2 黏度測定

采用流變儀測定乳液的流變學特性，實驗條件：平板直徑60 mm、間距1 mm、掃描范圍0.1～200 s-1。在20 ℃下測定剪切速率為65 s-1時的表觀黏度。

1.3.3.3 穩定性測定

采用Turbiscan Lab穩定性分析儀測定乳液穩定性。量取20 mL魚油納米乳液于儀器自帶的圓柱形玻璃杯中。玻璃杯外徑27.5 mm、高度70 mm。設置儀器參數：掃描時間6 h、環境溫度60 ℃、掃描間隔30 min，測定乳液穩定性指數（Turbiscan stability index，TSI）[3]。

1.3.3.4 乳化產率測定

采用紫外光譜法定量分析納米乳液的乳化產率[3]。分別以無水乙醇為溶劑配制不同質量濃度的魚油溶液，在最大吸收波長處測定吸光度，得到標準回歸方程。稱取一定質量的樣品溶液并記錄制備樣品時添加魚油的質量（m1/g），然后將樣品溶液在40 ℃水浴加熱15 min后，用超聲波處理1 h，取上層清液，容量瓶定容至50 mL，測定吸光度，根據標準回歸方程計算魚油質量（m2/g），通過公式（1）計算乳化產率。

1.3.4 魚油微膠囊理化指標的測定

1.3.4.1 包埋率測定

精確稱量5 g魚油微膠囊樣品于錐形瓶中，加入40 mL 50 ℃石油醚后低速攪拌浸提2 min，抽濾取濾液，濾渣中加入40 mL石油醚洗滌2 min，再次抽濾取濾液，合并濾液并轉移至恒質量的燒杯（m1/g）中，在65 ℃烘箱中烘干至恒質量（m2/g）。精確稱量5 g魚油微膠囊樣品并充分研磨，采用索氏提取法測定微膠囊中油的總質量/（m3/g）。通過式（2）分別計算樣品的包埋率[12]。

1.3.4.2 水分質量分數的測定

微膠囊水分質量分數的測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》，將0.5 g樣品置于鋁盤中105 ℃烘干12 h，根據公式（3）計算微膠囊水分質量分數。

式中：m0表示原始微膠囊質量/g；m1表示烘箱處理后樣品質量/g。

1.3.4.3 溶解度測定

取5 g樣品于燒杯中，加入50 mL蒸餾水，磁力攪拌至樣品充分溶解，將溶液轉移至離心管內，于4 500 r/min條件下離心10 min，取沉淀，加入50 mL蒸餾水攪拌溶解后再次離心，再次取沉淀并將其轉移至已稱質量的燒杯（m1/g）中，在105 ℃的烘箱內將其烘干至恒質量（m2/g），根據公式（4）計算微膠囊溶解度[13]。

式中：m表示樣品質量/g；ω表示樣品的水分質量分數/%。

1.3.4.4 微觀結構觀察

將少許微膠囊均勻分散在粘好電導膠的樣品平臺上，吹去多余粉末，樣品平臺置于離子濺射儀中噴金，電流強度10 mA、加速電壓5 kV，用掃描電子顯微鏡觀察微膠囊微觀形態結構。

1.3.4.5 熱重分析

稱取6 mg魚油微膠囊采用熱重分析儀進行熱重分析。在非等溫條件下，溫度從50 ℃升高至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮氣吹掃流量為80 mL/min。

1.3.4.6 過氧化值測定

將一定量的樣品均勻地鋪在錐形瓶底，放入（65±1）℃的隔水式恒溫培養箱中進行油脂的加速氧化反應，每天測定一次過氧化值。過氧化值參照SC/T 3505—2006《魚油微膠囊》[15]中微膠囊過氧化值測定方法測定。

1.3.4.7 FTIR光譜測定

稱取1 mg微膠囊，加入100 mg溴化鉀壓片后進行FTIR測定。測定波數范圍為400～4 000 cm-1的吸收光譜，設定分辨率4 cm-1、波數精度0.01 cm-1、掃描次數64、環境溫度25 ℃[16]。

1.4 數據處理與分析

實驗中所有數據以平均值±標準差表示，所有指標均重復測定3 次，利用SPSS Statistics 20.0軟件單因素方差分析的Tukey’s HSD法進行差異性檢驗，P＜0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件、PeakFit 4.12軟件進行數據分析、圖表處理及圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 均質工藝對魚油納米乳液理化指標及穩定性的影響

由表1可知，在不同均質條件下，隨著均質化強度的提高（空化射流時間延長、高壓均質壓力增大、超聲功率增大），平均粒徑呈現先降低后升高的趨勢。均質過程中的剪切力具有細化液滴、減小粒徑的作用，但過高強度剪切作用產生的緊密空化泡會屏蔽剪切力對液滴的影響，阻止液滴的分散，導致平均粒徑增加。經過空化射流處理的乳液最小平均粒徑為287.82 nm，較高壓均質和超聲破碎處理的最小平均粒徑低18.69 nm和39.67 nm。隨著均質化強度的提高，TSI先降低后升高，說明乳液穩定性先升高后降低，與此同時，黏度呈現先升高后降低的趨勢。空化射流工藝制備的納米乳液具有最低的平均粒徑，這是因為空化射流在空化過程中會產生使乳液中空化泡潰滅的微射流，有效促進了液滴的擴散，降低了納米乳液的平均粒徑[17]。高壓均質工藝制備的納米乳液具有較低的平均粒徑，這是因為高壓均質過程可以通過高強度剪切力作用來實現對魚油納米乳液粒徑的有效縮減。超聲工藝也能通過超聲空化效應實現魚油納米乳液的均質化，但是從平均粒徑角度衡量，其均質化效果明顯不如另外兩種均質工藝。納米乳液平均粒徑和乳液穩定性間存在相關關系，平均粒徑越小乳液穩定性越高，并且伴隨納米乳液平均粒徑的降低，納米乳液中液滴數量提高，促使納米乳液黏度增大。因此對比分析結果表明，空化射流均質工藝較高壓均質、超聲工藝能顯著降低魚油納米乳液的粒徑和提高乳液穩定性。但3 種均質工藝均存在過處理效應。

與空化射流相比，高壓均質和超聲破碎處理強度對乳液Zeta-電位影響較小。隨著空化射流處理時間的延長，納米乳液Zeta-電位絕對值先增大后趨于平穩。靜電排斥對帶電液滴聚集的穩定性起重要作用，Zeta-電位的絕對值越小意味著油滴之間形成的靜電排斥力更小，可能不足以克服液滴和能壘之間的分子間吸引力（即范德華力和疏水吸引力），從而引起乳液在自然條件下發生絮凝，液滴傾向于發生聚集，導致分層率增加[18]。而當Zeta-電位的絕對值大于30 mV時，依靠強靜電排斥即可穩定乳液液滴[19]，數據表明3 種均質方式形成的納米乳液都以這種方式保持穩定。對比3 種均質工藝發現，空化射流工藝的乳化產率最高，其次是高壓均質，超聲破碎乳化產率最低。均質工藝通過足夠高的能量輸入以減小納米乳液中液滴體積。根據冪律分布，可以將乳液的平均液滴直徑描述為能量密度（Ev）的函數，即每單位體積的能量輸入。因此，液滴直徑越小，乳化效率越高[20-21]。空化射流對乳化產率的影響可能歸因于其對蛋白質結構的影響，在空化腔內蛋白受到空化物理場的作用導致大的蛋白亞基轉變為小的亞基，進而形成水溶性聚集體，同時改變蛋白疏水性和結構柔性，降低表面界面張力和形成的乳液粒徑，從而影響大豆蛋白的乳化性和納米乳液的乳化產率[22]。

2.2 均質工藝對魚油微膠囊包埋率、溶解度和水分質量分數的影響

表 2 均質工藝對魚油微膠囊包埋率、溶解度和水分質量分數的影響Table 2 Effect of homogenization process on encapsulation efficiency,solubility and water content of fish oil microcapsules

由表2可知，隨著均質化強度的增加，空化射流和高壓均質工藝制成的微膠囊包埋率均呈現先升高后降低的趨勢。經過空化射流處理制得的微膠囊最大包埋率為87.44%，較高壓均質和超聲破碎處理的最大包埋率高出7.08%和8.80%。均質工藝通過改變蛋白質的水合能力以改變大豆蛋白作為微膠囊壁材的包埋能力，均質過程能促進水-蛋白質和蛋白質-蛋白質相互作用，改善大豆蛋白形成凝膠網絡的能力，進而提高微膠囊壁材的包埋能力[22-23]。而空化射流均質工藝制備的魚油微膠囊包埋率顯著高于高壓均質和超聲破碎工藝的原因可能在于空化射流誘導蛋白質發生一、二級結構變化，形成可溶性聚集體，而在高壓或熱處理條件下聚集體會發生二硫鍵/巰基的轉換，當巰基向二硫鍵方向轉化時，蛋白質形成凝膠和界面活性的能力發生改變[24]。因此，空化射流均質工藝可能通過形成粒徑更小的乳液液滴和更為穩定的乳液界面，進而提高噴霧干燥后魚油微膠囊的包埋率。

由表2可知，通過3 種不同均質工藝制備的微膠囊水分質量分數差異不顯著，制備的9 種微膠囊水分質量分數均介于4.7%～5.1%之間，水分質量分數較低，并和商品用微膠囊水分質量分數接近，達到SC/T 3505—2006規定的水分質量分數，不易發生霉變或結塊。3 種均質工藝得到的微膠囊均具有較高的溶解度，其中空化射流和高壓均質處理組具有更高的溶解度，超聲處理得到的微膠囊溶解性稍差。綜合魚油納米乳液和微膠囊的理化性質，優選空化射流10 min、高壓100 MPa、超聲400 W的均質工藝進行掃描電子顯微鏡觀察和穩定性實驗。

2.3 微膠囊的微觀結構

圖 1 均質工藝對魚油微膠囊微觀結構的影響Fig. 1 Effect of homogenization process on microstructure of fish oil microcapsules

如圖1所示，空化射流工藝所制得的微膠囊顆粒表面光滑、連續、致密、無裂紋和空隙。說明空化射流制備的微膠囊大豆蛋白對魚油進行了有效包埋，顆粒有部分向內的褶皺，但對微膠囊整體包埋效果影響不大。高壓均質工藝所制得的微膠囊表面連續性尚可，向內褶皺程度較大，顆粒表面有大量微孔。超聲破碎工藝制得的制得的微膠囊表面出現斷層和較大的孔洞。3 種均質工藝所得到的微膠囊均有少量小顆粒與大顆粒相互黏連，可能是干燥和冷卻過程中顆粒表面縮水導致；微膠囊顆粒表面多孔以及出現細紋的可能原因是壁材沒有完整地包裹內部芯材[25-26]。與另外兩種工藝相比，空化射流工藝所得到的魚油微膠囊微觀結構更為松散、圓滑和舒張，這可能是空化射流工藝處理后蛋白表現出較大的柔性，親水性基團的暴露使得蛋白的親水性增強；同時內部疏水基團向外伸展暴露，親油性增強，兩者達到良好的平衡[27]，納米乳液中蛋白質能完整地包裹在魚油油滴表面，使制得的微膠囊表面更加完整、光滑。這主要是因為空化射流均質工藝能更好地通過改變魚油外部的壁材結構和納米乳液性質，進而使微膠囊形成更加穩定和結構致密飽滿的微觀結構。這和空化射流均質工藝對魚油納米乳液微膠囊包埋率影響的結果相吻合。

2.4 均質工藝對魚油微膠囊熱穩定性的影響

從圖2可以看出，魚油微膠囊在500 ℃時基本完成分解。在150 ℃前，高壓均質和空化射流工藝制得的微膠囊具有良好的熱穩定性，質量損失速率隨溫度的升高而降低。可能原因在于溫度的升高使得微膠囊水分蒸發，表面硬化，阻止內部快速分解，而超聲破碎制得的微膠囊50～100 ℃時質量損失速率較高可能是由于顆粒包埋率較低，微膠囊表面的魚油快速氧化分解，降低了微膠囊整體的耐熱性。溫度在200～500 ℃區間內的質量損失主要來自于壁材的降解和內部魚油的蒸發，空化射流工藝組的魚油微膠囊先達到最大質量損失速率，但實際損失總量始終低于高壓均質工藝。這可能是因為空化射流均質工藝得到魚油微膠囊具有更加穩定和結構致密飽滿的微觀結構，從而導致結構熱穩定性提高。

圖 2 不同均質工藝微膠囊差熱分析曲線Fig. 2 Differential thermal analysis curves of fish oil microcapsules prepared by different homogenization processes

2.5 均質工藝對魚油微膠囊氧化穩定性的影響

圖 3 均質工藝對魚油微膠囊氧化穩定性的影響Fig. 3 Effect of homogenization process on oxidative stability of fishoil microcapsules

由圖3可知，被包埋魚油的氧化穩定性要高于暴露在空氣中的魚油。微膠囊由于有壁材的保護，有效阻隔了油脂與氧氣的直接接觸，氧化速率相對減緩。微膠囊顆粒表面油脂最先開始氧化，實驗過程中微膠囊顆粒過氧化值的下降可能是由于氧化油生成的過氧化物進一步氧化生成醛類和酮類物質[28-29]。隨著貯藏時間的延長，蛋白包裹魚油的微膠囊體系逐漸崩解，魚油通過微膠囊上的細孔或從微膠囊內部外溢與空氣直接接觸，促使微膠囊的過氧化值上升。經空化射流處理制備的微膠囊過氧化值曲線最為平緩，氧化速率最慢。高壓均質和超聲破碎處理制得的微膠囊過氧化值曲線相似。這可能是因為空化射流工藝形成的微膠囊微觀結構更為致密、平滑和無細微裂紋和具有更高的包埋率及較低的表面油含量，能更好地阻礙魚油和空氣接觸而發生氧化反應，減緩了魚油微膠囊的氧化速率[30-31]。

2.6 魚油微膠囊的FTIR分析結果

圖 4 魚油微膠囊FTIR光譜Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of fish oil microcapsules

由圖4可知，3 種魚油微膠囊在FTIR圖中1 065 cm-1和1 249 cm-1處的吸收峰分別對應磷脂酰膽堿PO2-的對稱振動和非對稱振動吸收譜帶。在2 800～3 000 cm-1范圍內形成相距80 cm-1的2 850 cm-1和2 930 cm-1的雙峰，分別對應脂肪族—CH2和—CH3的伸縮振動峰。1 600～1 700 cm-1和1 540 cm-1處分別對應大豆蛋白酰胺I帶和酰胺II帶。然而，圖譜在1 650～1 680 cm-1之間未出現含有分子內氫鍵的不飽和羧酸類單吸收峰，在1 745 cm-1處未出現代表不飽和雙鍵的伸縮振動峰，在3 010～3 100 cm-1范圍內僅出現較弱的代表不飽和雙鍵的伸縮振動單峰。FTIR結果表明，3 種均質工藝制得的魚油微膠囊壁材對芯材的包埋效果良好，未出現魚油外泄從而使魚油不飽和脂肪酸的FTIR吸收峰強度減弱現象。

3 結 論

空化射流工藝制備的納米乳液相較于高壓均質和超聲破碎有著較小的粒徑、較高的乳化產率和乳液穩定性。3 種均質方式制備的納米乳液在Zeta-電位和黏度方面相差不大。

納米乳液制備的微膠囊理化性質及穩定性與均質工藝有關，經過空化射流處理制備的微膠囊包埋率和溶解度相對較高，微膠囊顆粒呈球形，表面光滑，且熱穩定性和氧化穩定性能較好。高壓均質和超聲破碎制得的微膠囊包埋率和溶解度較差，顆粒表面分別出現微孔和較大的孔洞，熱穩定性和氧化穩定性較差。FTIR結果表明3 種微膠囊的包埋效果較好，未出現魚油外泄。因此，對比分析發現空化射流均質工藝是一種生產品質較佳的魚油納米乳液及微膠囊的新型均質工藝。