高靜水壓和熱處理對蕎麥蛋白功能性質的影響

周一鳴，杜麗娜，李云龍，周小理,，陳智東

（1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.山西省農業科學院農產品加工研究所，山西 太原 030031）

蕎麥是亞洲和中東歐地區的傳統作物，中國是世界蕎麥的最大生產國。近年來，蕎麥作為一種良好的功能營養食品原料越來越受到學界的關注[1]。蕎麥蛋白（buckwheat protein，BWP）是蕎麥中最主要的生物活性物質，其氨基酸組成均衡且富含人體限制性氨基酸——賴氨酸，其生物價相當于脫脂奶粉生物價的92.3%、雞蛋全粉生物價的81.5%[2]，但由于蕎麥中含有單寧、植酸和蛋白酶抑制劑，使得BWP具有較低的消化率，可以抑制體內脂肪的積累[3]。為此，部分學者對蛋白質的熱加工和非熱加工特性展開研究[4]，但對BWP熱加工和非熱加工后結構與乳化性的變化卻鮮有報道。由于傳統熱處理法（heat treatment，HT）具有方法簡便、設備投資少以及經熱變性蛋白不易回復的特點，不僅可以部分提高蛋白質的功能特性，而且可以擴大食品原料的應用范圍，成為國內較為普遍的食品加工方式[5]。隨著消費者對食品營養功能的需求增大，促進了非熱技術的研究與發展。高靜水壓（high hydrostatic pressure，HHP）處理作為一種非熱加工技術的代表，能修飾蛋白質中的二、三、四級結構，即會通過影響蛋白質的氫鍵、離子鍵、疏水鍵等非共價鍵，從而改變蛋白結構，對影響食品營養成分、風味物質等的共價鍵卻沒有影響，故能最大限度地保持食品原有的風味和營養。且HHP處理能適用于一些熱敏性物質，可以改善HT處理過程的種種缺陷[6]。鄭環宇等[7]報道HHP處理（300～500 MPa、20 min）后大豆蛋白的抗原性降低了50%以上，與未處理蛋白相比，HHP處理后的大豆蛋白具有較高的疏水性。郭蔚波等[8]研究發現卵蛋白經HHP處理（400～700 MPa、20 min）后，其免疫反應性隨著壓力的增加而降低，蛋白質結構和功能特性（起泡性和乳化性）的變化與壓力呈正相關。HHP技術在國外食品中的應用越來越廣泛，其作為一種冷殺菌技術，具有比HT處理對食物營養和感官品質破壞較小等多種優勢[9]。Sila等[10]以HHP和氯化鈣對胡蘿卜進行預處理，將預處理后的胡蘿卜進行HT處理，并對質構變化進行動力學分析，結果發現經預處理后樣品在HT處理過程中的軟化現象得到抑制。此外，HHP還會影響果蔬類產品的流變特性，這種影響與壓力和產品類型有關，與HT處理相比，經HHP處理后食品的黏度更大[11]。李興武等[12]在研究HHP殺菌及超聲波殺菌對紅李果醬的營養成分和感官品質的影響中指出HHP殺菌后果醬色澤得到改善，感官評分最高。本實驗采用HHP與HT處理（濕熱處理和干熱處理）兩類不同的加工方式，通過對處理后BWP結構及功能性質變化進行研究，以選擇能最大限度地保持或改善BWP品質的加工方式，為更好地利用BWP提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥粉購于山西雁門清高食品責任有限公司；BWP（粗蛋白質量分數62.95%）由實驗室自制。

5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽、8-苯胺基-1-萘磺酸、甘氨酸、三羥甲基胺基甲烷、三氯乙酸等（分析純）購自國藥集團（上海）化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

5L HHP 600 MPa高靜水壓設備包頭科發高壓科技有限責任公司；3-18K高速冷凍離心機美國Sigma公司；HH-4恒溫水浴鍋上海森地科學儀器有限公司；FTIR-850傅里葉變換紅外光譜儀天津港東科技股份有限公司；UV-2600紫外-可見光分光光度計、RF-6000熒光分光光度計日本島津公司；FD-80冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BWP的制備

參照王宏[13]的方法制備BWP。蕎麥粉經石油醚脫脂24 h，自然風干，按料液比1∶10溶于蒸餾水中，用1 mol/L NaOH溶液調至pH 8，在4 ℃、50 r/min條件下磁力攪拌2 h，攪拌完成后5 000 r/min離心20 min，取上清液，用1 mol/L HCl溶液調至pH 4.5，取沉淀，冷凍干燥24 h，于4 ℃冰箱儲存待測。

1.3.2 BWP的HT處理

濕熱法：BWP與水按照料液比1∶10混勻，并置于恒溫水浴鍋中，溫度100 ℃分別處理10、20、30 min，制得處理樣品，凍干待用。

干熱法：將BWP平鋪在搪瓷盤上，置于事先預熱的烘箱中，溫度100 ℃分別處理10、20、30 min，然后取出待用。

1.3.3 BWP的HHP處理

提前打開HHP的水浴循環裝置預熱至20 ℃，并將10 g BWP溶于100 mL蒸餾水中再進行真空包裝處理。隨后將真空包裝的樣品放入HHP處理腔中，壓力分別設置為100、300、500 MPa，保壓時間分別設置為10、20、30 min，泄壓過程在3 s內完成，以未處理樣品（0.1 MPa）作為空白對照組，取出樣品進行冷凍干燥后貯存于4 ℃冰箱中待用。

1.3.4 對BWP功能性質的測定

BWP溶解性參考Martínez等[14]的方法測定；起泡性及泡沫穩定性參考宋永令等[15]的方法測定；乳化性及乳化穩定性參考朱雪萍等[16]的方法測定。

1.3.5 BWP氧化指標的測定

BWP羰基參考郭麗萍等[17]的方法測定；巰基含量參考Grigera等[18]的方法測定；表面疏水性參考Zhao Feng等[19]的方法測定。

1.3.6 BWP二級結構分析

BWP二級結構參考Linsberger-Martin等[20]的方法采用傅里葉變換紅外光譜進行分析。

1.4 數據處理與分析

實驗重復3 次，取其平均值，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 16.0軟件處中Duncan法進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。同時，采用Origin Pro 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 HHP處理和HT處理對BWP功能性質的影響

2.1.1 HHP處理和HT處理對BWP溶解性的影響

溶解性是蛋白質水化作用的重要體現，溶解性對蛋白質乳化性、起泡性、凝膠作用等功能性質也具有影響。Cabanillas等[21]認為，蛋白質溶解性與氨基酸殘基的平均疏水性和電荷頻率有關。

圖 1 HHP處理和HT處理對BWP溶解性的影響Fig. 1 Effect of HHP treatment and HT on solubility of BWP

從圖1中可以看出，不同處理方式均可使BWP溶解性發生變化，其中，壓力達到100 MPa以上時，蛋白質溶解性均會有所提高，尤其是500 MPa HHP處理30 min時，BWP的溶解性達到最大值（65.5%），較空白對照組增加26.6%（P＜0.05）；濕熱與干熱處理也分別在30 min和10 min時溶解性增加46.10%和39.10%。但HHP與HT處理的加工原理有所不同，HT處理（干熱、濕熱）是通過破壞蛋白質的水合作用而增加溶解性，為不可逆過程；HHP處理則是使球狀蛋白從凝聚狀態通過分子解聚和伸展形成更小的亞基單位，從而釋放出內部的極性基團和疏水基團，使蛋白質分子的表面電荷數量增多、結合水增多，從而改善了溶解性，因此從保持或改善BWP溶解性以及節約時間的角度出發考慮，可以選擇濕熱處理（100 ℃、10 min）的方式對BWP進行加工。

2.1.2 HHP處理和HT處理對BWP起泡性及泡沫穩定性的影響

蛋白質若要具備起泡劑的性能則必須能在氣-液界面快速降低表面張力，通過分子間相互作用形成黏彈性膜并且易于在界面上展開和重排。特別是對于一些起酥性食品和發泡型飲料（如蛋糕、冰淇淋和啤酒等），這一性質尤為重要。

圖 2 HHP處理和HT處理對BWP起泡性及泡沫穩定性的影響Fig. 2 Effect of HHP treatment and HT on foaming ability and foam stability of BWP

從圖2中可以看出，HHP處理可以提高BWP的起泡性和泡沫穩定性，當壓力為500 MPa、時間為30 min時二者均達到最大值（91.5%和50.1%）；而HT處理會降低BWP的起泡性和泡沫穩定性，且BWP的起泡性和泡沫穩定性并未隨加熱時間的延長而發生明顯的變化。這可能是由于HT處理會導致蛋白質分子解聚、疏水性增強、分子柔性增大，對維持蛋白質的泡沫穩定性不利，且隨著HT處理溫度的升高，蛋白質聚集沉淀、黏度下降，使得BWP無法進行分子間相互作用，導致其不易在氣-液界面上展開和重排，從而降低起泡性和泡沫穩定性[22-23]。HHP可以改變蛋白質的三、四級結構，使得蛋白質更容易形成空氣與水的界面，同時由于極化作用使得蛋白質分子展開，形成了更加穩定的網絡結構以及更加穩固的界面膜，從而增強了BWP的起泡性和泡沫穩定性。因此，從保持起泡性及泡沫穩定性的角度考慮，可以選擇HHP（500 MPa、10 min）對BWP進行加工。

2.1.3 HHP處理和HT處理對BWP乳化性及乳化穩定性的影響

HHP處理可以促使蛋白質中的極性分子和水分子運動，使蛋白質的親水性和親油性提高，增加了蛋白質之間的相互作用，進而改善BWP的乳化性[24]。乳化性在食品的加工過程中具有重要作用，具有良好乳化性的食品擁有良好的口感。

圖 3 HHP處理和HT處理對BWP乳化能力及乳化穩定性的影響Fig. 3 Effect of HHP treatment and HT on emulsifying ability and emulsion stability of BWP

從圖3中可以看出，BWP的乳化性以及乳化穩定性均隨著HHP壓力的增加而總體得到改善，尤其在500 MPa、30 min時達到最大值（67.3 m2/g），較空白對照組升高16.1 m2/g，而HT處理顯著降低了BWP的乳化性及乳化穩定性（P＜0.05）。這可能是由于HT處理會導致蛋白質過度變性，產生許多的聚集體，使分子的溶解性降低，而少數蛋白質分子則可以在短時間內擴散到油-水分界面，從而導致其乳化效果明顯下降[25]。但隨著HHP處理壓力的增加，可溶性多肽含量增加，更多的蛋白質可以吸附在液滴油-水表面，使液滴絮凝橋聯程度降低，從而增加蛋白質的乳化性[26]，且HHP處理促進了蛋白質中極性分子和水分子的運動，改變了親水基團與親油基團的數目和比例，進而改善BWP的乳化性及乳化穩定性[27]。因此，為保持B W P 的乳化性，可以選擇H H P 處理（500 MPa、10 min）進行BWP加工。

2.2 HHP處理和HT處理對BWP氧化程度的影響

2.2.1 HHP處理和HT處理對BWP羰基含量的影響

羰基含量是評價蛋白質氧化程度的一個重要指標[28]。羰基含量的變化在一定程度上可以反映出蛋白質的氧化程度。從圖4中可以看出，兩類處理方式均可使BWP的羰基含量顯著增大（P＜0.05）。HT處理10 min羰基含量就已經超過了500 MPa HHP處理30 min時所達到的最大值（4.90 mmol/L）。這可能是由于HT處理過程中，蛋白質結構發生變化，導致蛋白變性，細胞膜結構被破壞，造成鐵及其他過渡金屬離子的釋放，一些亞鐵血紅素和各種氧化酶可能會作為產生活性氧和非氧自由基的催化劑[29]。這些自由基會攻擊BWP，對BWP氧化起到很強的催化作用，導致BWP羰基含量升高。羰基含量明顯上升也可能是HHP處理導致易氧化的成分暴露于氧氣中，從而加速氧化過程，同時，隨著壓力的上升，自由基不斷釋放，導致氧化速率加快，羰基含量增加[30]。

2.2.2 HHP處理和HT處理對BWP巰基含量的影響

HHP處理可使巰基基團暴露在分子表面，使其與空氣中的氧氣結合，形成二硫鍵，它的生成可以降低蛋白質的構象熵，使蛋白質結構變得穩定，從而賦予食品良好的熱穩定性[31-32]。且二硫鍵在維持蛋白質的食品功能性質中起重要作用，如面筋[33]、凝膠的形成[34]和蛋白質的成膜[35]等。

圖 5 HHP處理和HT處理對BWP巰基含量的影響Fig. 5 Effect of HHP treatment and HT on sulfhydryl content of BWP

從圖5中可以看出，不同處理方式均可使BWP的巰基含量發生變化，其中HT處理會明顯增加BWP的巰基含量，但隨著HT處理時間的延長，巰基含量略有下降，干熱處理100 ℃、30 min時巰基含量相對較低，但仍高出空白對照組2.76 μmol/L。而HHP處理則會降低BWP的巰基含量，且隨著HHP壓力的增大，BWP的巰基含量逐漸減少，尤其在500 MPa、30 min的處理條件下達到最小值（6.9 μmol/L），較空白對照組減少3.1 μmol/L。這可能是因為在熱變性溫度下蛋白質聚集體發生部分解離，暴露出二硫鍵，促使二硫鍵含量升高。而HHP處理能夠使蛋白酶的游離巰基含量增加，分子構象趨于去折疊態，致使巰基含量減少。蘇丹等[36]在研究HHP處理大豆分離蛋白時同樣發現與本實驗較為類似的現象，大豆分離蛋白的巰基含量在200 MPa的處理條件下略有提高，但在壓力為500 MPa時達到最小。

2.2.3 HHP處理和HT處理對BWP表面疏水性的影響

表面疏水作用在維持蛋白質的三級結構的穩定和四級結構的形成中占有突出地位[37]。疏水作用對蛋白質的穩定性、構象和蛋白質功能具有重要意義[38]。

圖 6 HHP處理和HT處理對BWP表面疏水性的影響Fig. 6 Effect of HHP treatment and HT on surface hydrophobicity of BWP

從圖6中可以看出，與未經處理的BWP相比，不同條件處理后BWP的表面疏水性發生了明顯改變。其中，BWP經500 MPa HHP處理20 min后由于暴露出更多的疏水性區域，其表面疏水性達到最大，較空白對照組增加約1 倍，表明BWP的三級和四級結構經HHP處理后發生了變化。而經HT處理的BWP表面疏水性低于空白對照組。這可能是隨著HT處理時間的延長，蛋白亞基之間會形成可溶或不可溶的聚集體，使暴露的疏水鍵和共價鍵相互作用，導致蛋白質發生嚴重的熱聚集，屏蔽了蛋白質的疏水區，減少了熒光探針結合的疏水基團，使得BWP的表面疏水性下降[39]。Kajiyama等[40]研究發現大豆蛋白在HHP處理下隨著壓力的增加表面疏水性上升。產生該現象的原因可能是HHP處理破壞了蛋白質分子中的弱氫鍵和范德華力，從而使蛋白質分子的結構發生改變，疏水基團暴露[41]。

2.3 HHP處理和HT處理對BWP二級結構的影響

傅里葉變換紅外光譜分析是分析蛋白質二級結構常用的方法之一，一般蛋白質在紅外光譜中被研究較多的是位于1 600～1 700 cm-1處的酰胺I帶、1 530～1 550 cm-1處的酰胺II帶和1 260～1 330 cm-1處的酰胺III帶[42]，BWP在相同時間下經HHP處理和HT處理的傅里葉變換紅外光譜如圖7所示。

圖 7 HHP處理和HT處理BWP的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 7 FTIR spectra of BWP subjected to HHP treatment and HT

表 1 HHP處理和HT處理后BWP二級結構含量Table 1 Contents of secondary structures in BWP subjected to HHP treatment and HT

隨著HHP處理壓力的增加和時間的延長，紅外光譜峰形發生了不同程度的改變，說明蛋白質二級結構發生了變化。其中酰胺I帶主要由蛋白多肽骨架的C＝O伸縮振動引起，吸收強度最強，是蛋白質二級結構變化的敏感區域，同時也與N—H的平面扭曲和C—N的伸縮振動有關[43-44]。利用Peak fit 4.12軟件對HHP處理產物的酰胺I帶采用去卷積二階導數擬合出蛋白二級結構含量，如表1所示。蛋白質的二級結構主要以β-折疊和β-轉角為主，且HHP處理后無規卷曲、β-轉角、β-折疊和α-螺旋的相對含量均發生了顯著的變化（P＜0.05），與未經HHP處理的BWP相比，HHP處理后的樣品二級結構中α-螺旋和β-折疊相對含量減少，β-轉角和無規卷曲相對含量有所增加，說明HHP處理導致BWP的二級結構發生了變化。其可能的原因是HHP處理后，—OH伸縮振動的特征吸收峰發生了紅移，導致蛋白質分子內氫鍵斷裂，且部分α-螺旋和β-折疊結構在HHP后轉變為無規卷曲[45]。HT處理使BWP變性，蛋白質分子亞基解離，有序結構舒展解折疊，導致β-轉角和無規卷曲相對含量也有所增加，但不顯著。

2.4 HHP處理BWP氧化程度與功能性質間相關性分析結果

表 2 HHP處理BWP氧化程度與功能性質相關性分析Table 2 Correlation analysis between structural and functional properties of BWP treated by HHP

對HHP處理后的BWP氧化程度與功能性質進行相關分析，由表2可知，經HHP處理后BWP的溶解性與乳化性、起泡性、羰基含量、巰基含量之間均存在一定的相關性。蛋白質的乳化能力對食品品質極為重要，且與溶解性成反比，一旦乳狀液形成，不溶性的蛋白質即起到穩定乳狀液的作用。其中，BWP的乳化性與起泡性、表面疏水性呈顯著正相關，同時與巰基含量呈極顯著負相關，與乳化穩定性、泡沫穩定性、羰基含量相關性不顯著；乳化穩定性與泡沫穩定性和表面疏水性呈顯著正相關。BWP的泡沫穩定性與乳化穩定性、起泡性、表面疏水性呈顯著正相關，相關系數大于0.9。說明蛋白質的表面疏水性變化和溶解性的升高是由蛋白氧化引起的，從而使蛋白質的結構發生改變，并且巰基-二硫鍵含量的變化與其功能特性的關系最為顯著，表面疏水性對蛋白質的泡沫穩定性與抗氧化性改善起到了重要作用。

3 結 論

不同的處理方式（HT和HHP）均會對BWP功能特性產生影響，但由于HT（干熱、濕熱）破壞了蛋白質的結構，對于食品的營養成分和感官品質破壞較大，而HHP處理解決了這一問題，它對食品的營養成分和感官品質影響較小，對生物大分子的共價鍵無影響，僅對非共價鍵（疏水鍵、離子鍵和氫鍵等）進行破壞。其中，HHP處理隨著壓力的增加和時間的延長，BWP的乳化性、起泡性均顯著增加，且在30 min、500 MPa時分別達到最大為67.3%和91.5%，BWP巰基含量顯著下降（P＜0.05），疏水性和羰基含量顯著增大（P＜0.05），說明HHP處理具有提高蛋白質乳化性、起泡性等功能性質的作用。傅里葉變換紅外光譜分析結果表明HHP處理后BWP的α-螺旋和β-折疊有序結構相對含量降低，無規卷曲相對含量增加，且暴露出更多的疏水性區域，引起蛋白中的構象表位被破壞或掩蓋，從而導致乳化性的改變。HHP處理后BWP氧化程度與功能特性相關性分析表明，表面疏水性的變化與其功能特性的關系最為顯著。BWP的表面疏水性和巰基含量呈顯著負相關（P＜0.05），與起泡性、乳化性呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01），說明表面疏水性的變化可以引起蛋白乳化性的變化，進而改變蛋白質的結構。在HT處理過程中，隨著加熱時間的延長，BWP的溶解性顯著升高（P＜0.05），BWP的羰基含量與溶解性呈極顯著正相關（P＜0.01），而與乳化性、乳化穩定性、起泡性、泡沫穩定性呈負相關，表明蛋白質的氧化對BWP的功能特性具有影響。