地黃烯醇化酶基因(RgENO)的生物信息學與表達分析

張丹丹，苑 璐，邵露營，朱佳琳，周延清*

(1.河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南省周口市科技局，河南 周口 466000)

0 引言

【研究意義】地黃(Rehmanniaglutinosa)是一種栽培歷史悠久的大宗中草藥，屬于玄參科地黃屬多年生草本植物，具有重要的藥用、食用、觀賞和經(jīng)濟價值。其根以鮮地黃、生地黃和熟地黃等形式用于臨床實踐，具有養(yǎng)陰生津、清熱涼血和抗腫瘤等功效，是六味地黃丸和知柏地黃丸等中成藥的重要原料。地黃富含梓醇、地黃苷、毛蕊花糖苷和糖類等諸多藥效成分。其中，地黃糖類包括水蘇糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、毛蕊花糖、果糖、半乳糖和甘露三糖等。因此，研究地黃糖酵解關鍵酶基因對于闡明其代謝途徑和品種改良具有重要意義。【前人研究進展】植物糖酵解涉及的酶相當多，其中，烯醇化酶是廣泛存在于動植物體糖酵解過程中的一個重要限速酶,催化磷酸甘油酸脫水形成磷酸烯醇式丙酮酸，在植物中具有催化糖酵解、抗逆、影響植物的生長和生殖發(fā)育和轉錄調(diào)控等多種功能[1]。目前，已經(jīng)從擬南芥、茶樹、鹽芥、水稻和玉米等植物中克隆了烯醇化酶，研究了其功能[2]。但是，少見地黃烯醇化酶基因的報道。【研究切入點】在前期的地黃塊根轉錄組測序挖掘毛蕊花糖苷生物合成途徑相關酶及其相應基因、闡明其合成途徑及分子機理的研究中挖掘的大量地黃基因[3]，包括7個糖酵解酶基因，烯醇化酶基因為其中之一。烯醇化酶不僅是糖酵解的關鍵限速酶，而且具有抗逆、參與植物的轉錄調(diào)控、生長發(fā)育等功能[1]。因此，對地黃烯醇化酶基因進行進一步研究。【擬解決的關鍵問題】以前期轉錄組測序挖掘的地黃品種溫85-5的糖酵解關鍵酶-烯醇化酶基因堿基序列為材料[3]，利用計算機和生物信息學軟件研究地黃烯醇化酶基因(RgENO)編碼蛋白質的同源性、理化性質空間結構、跨膜結構區(qū)、亞細胞定位、信號肽分析及根、莖和葉中的表達情況，為進一步深入研究該基因的結構特征和糖酵解及抗逆功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

地黃品種溫85-5成熟植株的根、莖和葉。地黃發(fā)育根轉錄組測序挖掘烯醇化酶(EC：4.2.1.11)基因Contig4172，780 bp[3]，命名為RgENO。內(nèi)參基因RgTIP41引物序列和擴增產(chǎn)物詳見文獻[3]。RT-qPCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII購自TAKARA公司(日本)。

1.2 方法

利用軟件Primer Premier 5.0 設計qRT-PCR引物。引物方向5′→3′，正向引物：TGAGTGGGGTTGGTGTAAGC；反向引物：ATTGATGACATTGAAAGCGGG，引物為英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，預期擴增產(chǎn)物172 bp；NCBI的Blastp同源性檢索，ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對RgENO理化性質分析，應用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和KinasePhos2.0(http://kinasephos2. mbc.nctu. edu. tw/index.html)預測RgENO蛋白質的跨膜區(qū)和對磷酸位點進行分析，SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對地黃RgENO氨基酸序列進行信號肽分析，SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_ sopm.html)分析RgENO蛋白的二級結構，InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析RgENO蛋白的結構域；用改良后的Trizol法提取地黃品種溫85-5植株的根、莖、葉的總RNA，用紫外微量分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳分別檢測所提RNA的濃度和完整度。qRT-PCR 在LightCycler 96實時定量PCR儀上進行，具體程序參見文獻[3]。采用2-△△Ct方法計算RgENO的相對表達量[3]。用Microsoft Office Excel 2007作RgENO的空間表達圖。

2 結果與分析

2.1 RgENO同源比對

根據(jù)RgENO的堿基序列，利用NCBI中的BLASTp軟件搜索發(fā)現(xiàn)，RgENO基因與芝麻(基因注冊號XP_011094426.1)、大豆(NP_001237329.2)、猴面花(XP_012840098.1)、可可(EOY08109.1)和長蒴黃麻(OMO68215.1)的烯醇化酶基因編碼蛋白質的氨基酸序列同源性分別高達96%、91%、94%、94%與93%(圖1)。

圖1 RgENO的多重同源比對結果 Fig.1 Multiple homology alignment result of RgENO

2.2 RgENO編碼酶的理化性質

在線軟件預測RgENO基因編碼蛋白質由260個氨基酸殘基組成，包括26個酸性氨基酸(Asp+Glu)和27個堿性氨基酸(Arg+Lys)，相對分子量為27 654.69，等電點是7.69，分子式是C1233H1965N329O373S9，不穩(wěn)定系數(shù)為24.73，脂溶指數(shù)為90.46，總平均親水性(GRAVY)為-0.120，由此推測RgENO蛋白為穩(wěn)定、親水性蛋白；采用Kinase Phos 2.0對RgENO進行磷酸化結構預測，其具有12個絲氨酸的磷酸化位點(8、10、11、25、33、37、89、131、150、151、、223、248)，10個蘇氨酸的磷酸化位點(12、41、53、56、69、179、203、211、228、231)和9個酪氨酸的磷酸化位點(15、27、105、163、174、210、226、232、256)。

2.3 RgENO蛋白質的跨膜結構

一般當X軸數(shù)值高于500時，可以認作是跨膜結構域。用TMHMM Server v.2.0預測地黃RgENO蛋白質的跨膜結構結果(圖2)表明，RgENO編碼酶無跨膜結構。

2.4 RgENO蛋白質的信號肽預測與保守結構域預測

將RgENO的氨基酸序列輸入Signalp-5.0在線工具，進行信號肽預測結果發(fā)現(xiàn)，RgENO不具有跨膜運輸功能，屬于非分泌型蛋白。利用InterProScan和NCBI的Conserved domains search預測RgENO具有烯醇化酶所具有的N-端和C-端保守結構域。在氨基酸序列的116-260位C末端有TIM barrel domain，屬于TIM磷酸結合超家族。

2.5 RgENO蛋白質的空間結構預測

采用SOPM預測ENO蛋白的二級結構表明,α螺旋40%，無規(guī)則卷曲31.54%，伸展鏈19.23%，β轉角9.23%。因此認為，RgENO的二級結構主要為α螺旋、無規(guī)則卷曲和β轉角組成。

2.6 RgENO蛋白質的亞細胞定位

使用WoLF PSORT蛋白亞細胞定位預測方法[4]對RgENO蛋白質進行亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，在其K最臨近值在細胞核、線粒體、細胞質、分泌系統(tǒng)囊泡、過氧物酶體和液泡中的值依次為34.8%、30.4%、21.7%、4.3%、4.3%和4.3%，RgENO蛋白質在細胞核中定位的K最臨近值最大，可能定位與細胞核中。

2.7 RgENO的空間表達

以RgTIP41為內(nèi)參基因，用qRT-PCR技術檢測RgENO在地黃塊根、莖和葉中的相對表達量結果(圖3)表明，RgENO在莖中的表達量最高，其次是葉中，塊根中最低。

圖3 RgENO基因在成熟地黃植株塊根、莖和葉中的表達量Fig.3 Expressions of RgENO gene in tuber, stem and leaves of matured R. glutinosa

3 討論

研究用轉錄組測序地黃烯醇化酶基因RgENO，用生物信息學分析軟件對其分析發(fā)現(xiàn)，其與其他植物種類的烯醇化酶基因同源性高達91%～96%，具有烯醇化酶所具有的N-端和C-端保守結構域(TIM barrel domain)，屬于烯醇化酶。其他植物種烯醇化酶基因研究表明，其催化糖酵解過程，具有抗逆性等功能。如從耐低溫馬鈴薯品種中克隆的糖酵解途徑上的StEnolase基因，一定程度上能夠調(diào)控馬鈴薯塊莖低溫糖化，影響轉基因株系芳香族氨基酸的合成[5]；脅迫響應基因可通過依賴脫落酸信號途徑和非依賴脫落酸信號途徑進行調(diào)控[6]；茶樹CsENO在脫落酸脅迫下能表達且受到不同程度的誘導，屬于依賴脫落酸信號通路的植物逆境響應基因[7]；在植物抗冷脅迫中還存在一種非脫落酸依賴的信號通路-CBF/DREB調(diào)控網(wǎng)絡。CBF/DREB基因編碼轉錄因子，其表達產(chǎn)物與植物的冷響應基因COR的順式元件結合，誘導抗冷基因表達來提高植物的抗冷性[8]。擬南芥CBF基因的下游調(diào)控因子los2經(jīng)過驗證是烯醇化酶基因，是一個雙功能酶基因，其間接地正調(diào)控冷應答COR基因，提高擬南芥的抗冷性[9]。因此，地黃烯醇化酶基因RgENO的發(fā)掘與功能預測對地黃糖代謝與抗逆性分子機制研究提供參考。另一方面，qRT-PCR技術檢測地黃不同器官組織中RgENO基因均表達，但是表達量差異不明顯，說明其是組成型表達，對于地黃糖代謝與抗逆具有重要作用。

4 結論

RgENO基因與芝麻、大豆、猴面花、可可和長蒴黃麻(OMO68215.1)烯醇化酶基因編碼蛋白質的氨基酸序列同源性較高，分別達96%、91%、94%、94%和93%；RgENO蛋白為穩(wěn)定、親水性蛋白；其具有12個絲氨酸的磷酸化位點、10個蘇氨酸的磷酸化位點和9個酪氨酸的磷酸化位點。RgENO編碼酶無跨膜結構及信號肽，二級結構主要為α螺旋、無規(guī)則卷曲和β轉角組成，蛋白質可能定位于細胞核中；RgENO在地黃的塊根、莖和葉中均有不同水平的表達，但在莖中的表達量最高，在塊根中最低。研究結果可為今后深入研究地黃烯醇化酶基因(RgEND)的結構特征和糖酵解及抗逆功能提供參考。