貴州生姜組培脫毒快繁體系的建立

王少銘，羅莉斯，侯穎輝，冷家歸，李德文

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 香料研究所，貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】姜(ZingiberoffcinaleRoscoe)為姜科多年生草本植物，又稱生姜、黃姜等，在我國(guó)中部、東南至西南各省區(qū)廣為栽培[1-3]。貴州是生姜主產(chǎn)區(qū)之一，常年種植面積2.7萬hm2，優(yōu)良地方品種有遵義大白姜、鎮(zhèn)寧小黃姜、貞豐小黃姜等。近年來，隨著貴州省農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和“十二大產(chǎn)業(yè)”的縱深發(fā)展，生姜成為助推脫貧攻堅(jiān)的優(yōu)勢(shì)品種。在生姜主產(chǎn)區(qū)安順、黔南州等地，生姜的種植面積迅速提升。然而，長(zhǎng)期的無性繁殖導(dǎo)致生姜種性退化，產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性下降，利用脫毒快繁技術(shù)對(duì)種姜進(jìn)行提純復(fù)壯，能夠降低或清除種姜有害病毒和細(xì)菌，提高生姜產(chǎn)量，減少農(nóng)藥施用量。【前人研究進(jìn)展】目前省內(nèi)關(guān)于生姜組培脫毒快繁技術(shù)的研究不多，已見報(bào)道的研究材料均為小黃姜，白姜的相關(guān)報(bào)道更少。【研究切入點(diǎn)】貞豐小黃姜是近年黔西南州的主栽地方品種，香味濃郁、品質(zhì)優(yōu)良；湄潭大白姜是遵義地區(qū)的主栽品種，纖維較少、質(zhì)地脆嫩、辛辣味淡。貞豐、湄潭兩地生姜栽培多年后出現(xiàn)種性退化，產(chǎn)量下降。目前，鮮見關(guān)于貞豐小黃姜及湄潭大白姜組培脫毒快繁的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】為解決貞豐小黃姜及湄潭大白姜品種退化的問題，以貴州省貞豐小黃姜和湄潭大白姜為材料，采用高溫鈍化+莖尖脫毒技術(shù)，優(yōu)化生姜莖尖誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)條件，選擇合適的育苗盤和基質(zhì)，構(gòu)建貴州生姜組培脫毒快繁體系，以期為貴州生姜種業(yè)的工廠化育苗提供技術(shù)支撐，為貴州生姜主產(chǎn)區(qū)生姜地方品種提純復(fù)壯提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州省貞豐縣小黃姜(ZF)，遵義市湄潭縣大白姜(MT)，試驗(yàn)材料均在當(dāng)?shù)刂鳟a(chǎn)區(qū)收集，并種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所試驗(yàn)地。

試劑：TMV檢測(cè)試劑盒、CMV檢測(cè)試劑盒(北京東歌博業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn))，其他試劑為植物組織培養(yǎng)基本試劑。

儀器：DNM-9602G型酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)、XYH-2A型解剖鏡(上海永享光學(xué)儀器制造有限公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、RXZ型智能人工氣候箱(寧波東南儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 外植體的處理 挑選飽滿、大塊、肉色光亮的健康貞豐小黃姜和湄潭大白姜姜塊，沖洗干凈后用500倍多菌靈(80%含量)浸泡殺菌1 h，晾干后用進(jìn)口泥炭土覆蓋并適量澆水，28℃恒溫培養(yǎng)，濕度維持在80%左右。待姜芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，分批對(duì)姜芽進(jìn)行高溫處理，55℃處理5～8 min。

1.2.2 莖尖剝離 將高溫處理過的姜芽用自來水沖洗30 min，用75%酒精消毒45 s，無菌水清洗干凈，再用0.1%升汞溶液消毒8 min，無菌水清洗3～4次。在超凈工作臺(tái)中利用雙目解剖鏡剝離生姜莖尖，切除離葉原基0.1～0.2 mm的莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.3 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的考察 以莖尖分生組織誘導(dǎo)成苗階段使用的培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將莖尖接種到不同激素配比的培養(yǎng)基中，共9個(gè)處理，Y1～Y9處理6-BA(mg/L)與NAA(mg/L)的配比分別為1∶0.1、2∶0.1、3∶0.1、1∶0.3、2∶0.3、3∶0.3、1∶0.5、2∶0.5和3∶0.5。其中MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加3%蔗糖，0.7%瓊脂，pH為5.8～6.0，于25～28℃，光照1 500～3 000 lx(14 h/d)條件下培養(yǎng)。于接種30 d統(tǒng)計(jì)莖尖膨大率，80 d調(diào)查誘導(dǎo)不定芽數(shù)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.4 不同增殖培養(yǎng)基的考察 去除誘導(dǎo)苗葉片和根，將莖基部分別接種于不同激素配比的培養(yǎng)基中，共8個(gè)處理，Z1～Z8處理6-BA(mg/L)與NAA(mg/L)的配比分別為1∶0.1、3∶0.1、5∶0.1、7∶0.1、1∶0.3、3∶0.3、5∶0.3和7∶0.3。其中MS為基本培養(yǎng)基，添加3%蔗糖，0.7%瓊脂及0.2%活性炭，pH為5.8～6.0，于25～28℃，光照1 500～3 000 lx(14 h/d)條件下培養(yǎng)。分別于接種20 d及50 d調(diào)查增殖及生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。

1.2.5 組培苗病毒檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒對(duì)生姜組培苗中的煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)進(jìn)行檢測(cè)。取誘導(dǎo)苗葉片1 g，按照試劑盒說明書的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，每株樣品3次重復(fù)。TMV和CMV的OD臨界值分別為0.163和0.159。若樣品OD值大于臨界值為陽性，小于臨界值則為陰性。

1.2.6 組培苗移栽 選用ZF脫毒組培苗作為材料，分別優(yōu)化不同培養(yǎng)基質(zhì)和不同規(guī)格育苗盤。于3月初將組培苗移栽到裝有3種培養(yǎng)基質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)土、蛭石∶珍珠巖=3∶1、泥炭土∶珍珠巖=5∶1)的72孔穴盤中，溫室中培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)成活率和生長(zhǎng)情況，選擇適宜的移栽基質(zhì)后，將篩選到的基質(zhì)分別裝入3種規(guī)格的育苗盤(50孔、72孔、128孔)中，栽上組培苗在溫室中培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)成活率和生長(zhǎng)情況。

1.2.7 組培苗定植 4月中下旬，待育苗盤中的脫毒苗具6～8片葉、長(zhǎng)滿新根后定植到隔離網(wǎng)室，定苗時(shí)澆透定根水，作遮陰(遮陰度50%)和未遮陰處理，40 d后統(tǒng)計(jì)成活率和生長(zhǎng)情況，隨機(jī)抽取50株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)成活率；隨機(jī)取10株進(jìn)行農(nóng)藝性狀測(cè)量，3次重復(fù)，測(cè)量指標(biāo)為株高、分枝數(shù)、主莖葉片數(shù)、主莖倒3葉的葉長(zhǎng)及葉寬，田間定植后按照生姜栽培日常管理。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果采用DPS 17.10進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)姜芽誘導(dǎo)的影響

生姜莖尖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7 d左右開始膨大，30 d后趨于穩(wěn)定，ZF和MT在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中膨大數(shù)差異較大。從表1可知，在接種30 d時(shí)，膨大率ZF為45%～90%，MT為59%～95%，ZF和MT誘導(dǎo)膨大的最佳培養(yǎng)基分別為Y3和Y2。莖尖膨大后繼續(xù)培養(yǎng)，顏色由白轉(zhuǎn)淡綠，后出現(xiàn)凸起形成姜芽，姜芽繼續(xù)長(zhǎng)成姜苗，同時(shí)在姜芽旁會(huì)形成新的姜芽。在接種80 d時(shí)，不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)ZF和MT的誘導(dǎo)率差異較大，分別為35%～81%和41%～90%，誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基分別為Y3和Y2。說明NAA最適濃度為0.1 mg/L，過高的NAA含量不利于生姜莖尖的分化和誘導(dǎo)；而6-BA的最佳濃度為2～3 mg/L，不同品種生姜莖尖誘導(dǎo)所需的激素比例不同。

表1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的生姜莖尖分化情況Table 1 Ginger stem tip differentiation with different inducing media

2.2 生姜誘導(dǎo)苗的病毒檢測(cè)

從圖1可知，扣除空白對(duì)照后，TMV和CMV的陽性對(duì)照平均分別為1.731和1.487，陰性對(duì)照平均分別為0.013和0.009，均符合試驗(yàn)有效性要求。檢測(cè)的ZF和MT共30個(gè)樣品均為陰性，說明誘導(dǎo)苗不含TMV和CMV。樣品送至北京中科光析化工技術(shù)研究所進(jìn)行第三方檢測(cè)，均為陰性。

圖1 生姜誘導(dǎo)苗的TMV和CMV檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of TMV and CMV test on ginger induced seedling

2.3 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)組培苗擴(kuò)繁效率的影響

由表2可知，8種增殖培養(yǎng)基均能產(chǎn)生分蘗，但產(chǎn)生分蘗的數(shù)量不同，其中Z3的增殖效果最佳，在20 d時(shí)可使ZF和MT分別增殖2.5倍和2.4倍；50 d時(shí)增殖7.3倍和6.9倍。隨著6-BA濃度的增加，組培苗分蘗數(shù)也越多，當(dāng)6-BA濃度為5 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)達(dá)最大，繼續(xù)增加6-BA的含量，增殖效果不明顯。NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，組培苗的肉質(zhì)根較少，增加NAA濃度肉質(zhì)根增多。綜合比較，ZF和MT的擴(kuò)繁選擇Z3(MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.1 mg/L)培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)40～50 d后進(jìn)行2～3次繼代，無需進(jìn)行生根培養(yǎng)，于每年3月待組培苗株高8～10 cm或具4～6片葉時(shí)可進(jìn)行移栽。

2.4 不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽的影響

試驗(yàn)表明，以泥炭土和珍珠巖混合比為5∶1的組合最佳，其組培苗成活率在96%以上，新根3～5條，須根布滿基質(zhì)，葉片深綠；以蛭石和珍珠巖按3∶1混合的基質(zhì)次之，其成活率為88%；以營(yíng)養(yǎng)土為基質(zhì)的組培苗成活率為75%，新根少，葉片黃綠色。

2.5 不同規(guī)格育苗盤對(duì)組培苗移栽的影響

試驗(yàn)表明，50孔、72孔和128孔3種規(guī)格的育苗盤中組培苗的成活率分別為96.7%、97.2%和98.2%，3種規(guī)格育苗盤中的姜苗長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，葉色深綠，植株健壯，根系發(fā)達(dá)。但考慮成本因素，選用128孔的育苗盤移栽最佳。

2.6 遮陰對(duì)組培苗定植的影響

由表3可見，遮陰處理可以極顯著提高生姜組培苗的成活率，遮陰處理的成活率可達(dá)96%左右，而未遮陰成活率為83%左右；同時(shí)姜苗的長(zhǎng)勢(shì)極顯著優(yōu)于未遮陰，特別是遮陰處理的分枝數(shù)和主莖葉片數(shù)極顯著高于未遮陰。姜苗由溫室環(huán)境進(jìn)入室外環(huán)境需要過度，強(qiáng)光照和高溫容易灼傷幼嫩的姜苗，遮陰可以降低光照強(qiáng)度和環(huán)境溫度，使姜苗慢慢適應(yīng)外界的環(huán)境。定植組培苗時(shí)建議進(jìn)行遮陰處理，遮陰處理2個(gè)月左右，注意夏季高溫同樣需進(jìn)行遮陰，后續(xù)的田間操作按照生姜的日常管理即可。

表3 遮陰處理組培苗的生長(zhǎng)情況Table 3 Growth situation of tissue culture seedlings under shading treatment

3 討論

組培脫毒快繁技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蔬菜、果樹等種苗的提純復(fù)壯[4-5]，具有較廣的應(yīng)用前景。有關(guān)生姜組培脫毒及快繁的報(bào)道不斷增多，應(yīng)用莖尖分生組織誘導(dǎo)技術(shù)可以成功脫菌脫毒，并且均能誘導(dǎo)不定芽獲得脫毒組培苗[6-8]，添加激素多為6-BA和NAA，葛勝娟[9]研究認(rèn)為，添加6-BA和NAA的培養(yǎng)基更能夠促進(jìn)生姜幼芽的分化和增殖。試驗(yàn)表明，在誘導(dǎo)階段，隨著6-BA含量的增加，生姜的誘導(dǎo)率隨之增加，6-BA含量在2～3 mg/L誘導(dǎo)率較高，與齊蘭等[6-7]的研究結(jié)果一致；不同生姜品種分化誘導(dǎo)所需的激素含量有所差異，小黃姜所需6-BA的濃度較高。黃明等[10]研究表明，貴州六盤水小黃姜莖尖誘導(dǎo)分化最適6-BA濃度為3.5 mg/L。增殖擴(kuò)繁階段，較高的NAA濃度會(huì)導(dǎo)致肉質(zhì)根的增多，不利于姜苗的轉(zhuǎn)接和生長(zhǎng)；隨著6-BA濃度的增加，組培苗分蘗增多，當(dāng)6-BA濃度為5 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)達(dá)最大，繼續(xù)增加6-BA的含量，增殖效果不顯著。在每個(gè)繼代和增殖周期，組培苗均能生根，無需進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果與吳家麗等[7，11]一致。隨著繼代數(shù)增加，在培養(yǎng)基中添加活性炭可吸附有害的次生代謝產(chǎn)物。組培苗移栽的最佳基質(zhì)為泥炭土與珍珠巖按5∶1進(jìn)行混合，該基質(zhì)疏松保水，利于姜苗的生根和生長(zhǎng)，128孔穴盤移栽姜苗最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，既節(jié)約空間又不會(huì)阻礙姜苗的生長(zhǎng)。田間定植時(shí)適當(dāng)遮陰可顯著提高姜苗的成活率，促進(jìn)姜苗健康成長(zhǎng)。

4 結(jié)論

篩選出最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2～3 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 5mg/L+NAA 0.1 mg/L+0.2%活性炭。建立的貴州生姜組培脫毒快繁體系，可促進(jìn)生姜幼芽的分化和增殖及姜苗的健康成長(zhǎng)。可在相應(yīng)種植地區(qū)進(jìn)行推廣。